Summary

Bio-strato Interferometria per Cinetica di interazioni proteina-proteina e allosterici effetti Ligand di misura

Published: February 18, 2014
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Summary

I protocolli che seguono descrivono saggi cinetici di interazioni proteina-proteina con Bio-strato Interferometria. F-tipo ATP sintasi, che è coinvolto nel metabolismo energetico cellulare, può essere inibita dalla sua subunità ε nei batteri. Abbiamo adattato Bio-strato interferometria per studiare le interazioni del complesso catalitico con il dominio C-terminale inibitorio di ε.

Abstract

Descriviamo l'uso di Bio-strato interferometria per studiare le interazioni inibitorie della subunità ε con il complesso catalitico di Escherichia coli ATP sintasi. Batterica di tipo F ATP sintasi è l'obiettivo di un nuovo antibiotico approvato dalla FDA per combattere la tubercolosi resistente ai farmaci. Capire specifici batteri-auto-inibizione della ATP sintasi dal dominio C-terminale della subunità ε potrebbe fornire un nuovo mezzo per indirizzare l'enzima per la scoperta di farmaci antibatterici. Il dominio C-terminale di ε subisce un drastico cambiamento conformazionale quando le transizioni tra gli stati di enzimi attivi e inattivi, e ligandi catalitica-portale possono influenzare quale delle conformazioni di ε è predominante. Le cinetiche di saggio misura di ε legante / dissociazione con il complesso catalitico, e indirettamente meaSures lo spostamento di ε enzima legato alla e dalla conformazione inibitorio apparentemente nondissociable. Il segnale interferometria Bio-strato non è eccessivamente sensibili composizione della soluzione, in modo che possa essere utilizzato anche per monitorare gli effetti dei ligandi allosterici catalitica-portale sulle variazioni conformazionali di ε.

Introduction

Interazioni proteina-proteina sono importanti per molti processi biologici e metodi ottici label-free come Surface Plasmon Resonance (SPR) sono stati utilizzati in vitro per studiare la cinetica di legame e di dissociazione 1. La maggior parte dei metodi di label-free immobilizzare uno biomolecole su una superficie del sensore e utilizzare un segnale ottico per rilevare un partner di legame dalla soluzione in quanto si associa con la biomolecola immobilizzata 1. Mentre SPR è un metodo altamente sensibile, è soggetta a interferenze dovute a variazioni dell'indice di rifrazione della soluzione scorre sopra il sensore 2. Anche se non è così sensibile come SPR, Bio-strato Interferometria (BLI) è meno influenzata dai cambiamenti nella composizione del campione 1,3. BLI utilizza biosensori in fibra ottica che hanno un rivestimento biocompatibile proprietaria alla punta. Il sistema utilizzato here (Octet-RED96) contiene otto spettrofotometri. La luce bianca viene convogliata ad una fila di sonde che si muovono su un braccio robotico. Sensori in fibra ottica are raccolto dalle sonde e spostata in una piastra a 96 pozzetti contenenti campioni. Una delle molecole bersaglio è immobilizzato sulla superficie del biosensore. Poi sensori vengono spostati pozzetti contenenti il ​​partner di legame in soluzione. BLI monitora associazione del partner di legame con la molecola immobilizzata, quindi controlla dissociazione dopo aver spostato i sensori di soluzione senza il partner di legame. Il legame di molecole di superficie biosensore comportano modifiche interferenza ottica tra le onde luminose che riflettono indietro ai spettrofotometri da una superficie interna e dall'interfaccia esterna tra il sensore e la soluzione. Questi cambiamenti di interferenza possono essere quantificate e utilizzati per determinare i tassi cinetiche di legame e di dissociazione, come riassunto nell'animazione della figura 1.

Abbiamo applicato BLI per misurare le interazioni tra il complesso catalitico di ATP sintasi batterica e la sua subunità ε, che può auto-inibire l'enzima. ATP synthase è un nanomotor rotativo membrana integrato che catalizza la sintesi e idrolisi di ATP 4. Il complesso catalitico (F 1) può essere isolato in forma solubile che funziona come un ATPasi. Subunità ε ha due domini: il dominio N-terminale (NTD) è necessaria per il corretto montaggio e l'accoppiamento funzionale dell'enzima, ma non interagire direttamente con le subunità catalitiche, il dominio C-terminale (CTD) in grado di inibire l'enzima interagendo con più subunità catalitiche 5,6. Questo regolamento ε-mediata è specifico per ATP sintasi batteriche e non è osservata nel omologo mitocondriale. ATP sintasi è emerso come un bersaglio per farmaci antibatterici, come dimostrato dalla recente approvazione della FDA di bedaquiline per il trattamento della tubercolosi farmaco-resistente 7. Così, il targeting ruolo inibitorio di ε per la scoperta della droga potrebbe produrre antibatterici che non inibiscono la mitocondriale ATP sintasi. Con l'isolato complesso catalitico (F 1), εdiventa una subunità dissociabile. Tuttavia, con ε vincolato a F 1, il εCTD può subire un drastico cambiamento conformazionale, parzialmente inserito nella cavità centrale dell'enzima e formando uno stato inibitorio che difficilmente dissociare direttamente 6,8. Usiamo BLI per misurare cinetica di F 1 / ε associazione e la dissociazione e, indirettamente, per esaminare gli effetti allosterici di catalizzatore sito ligandi sulla conformazione di ε.

Nel nostro sistema, ε è stato scelto per l'immobilizzazione sulla superficie del sensore dal segnale BLI (come SPR) è sensibile alla massa dei leganti in superficie molecole. La subunità ε è piccolo (~ 15 kDa) rispetto alla principale F 1 complesso (~ 347 kDa). Così, un segnale BLI più grande sarà il risultato di legame di F 1 a ε immobilizzato. Per monitorare F 1 dissociazione, che può essere molto lento, ε deve essere fortemente immobilizzato. Così abbiamo scelto di biotinylateE immobilizzarlo sul biosensori rivestite di streptavidina. Le proteine ​​possono essere biotinilati (i) modifica casuale di lisine superficie 9, (ii) reazione di un unico cisteina nativa o attrezzata con biotina-maleimmide reagente 10 o (iii) geneticamente aggiungendo uno specifico peptide biotina-accettore che viene enzimaticamente biotinilato durante espressione in vivo della proteina marcata 11. Nel nostro sistema, ε è biotinilato utilizzando il metodo (iii) 8. Una volta ε biotina-tag è immobilizzato su sensori streptavidina, BLI può misurare l'associazione e dissociazione di F 1, che è stato impoverito di subunità ε (F 1 (-ε)). Per gli esperimenti qui descritti, saggi preliminari sono stati condotti per determinare ragionevole quantità di proteina biotinilato per immobilizzare sui sensori. Questo può variare, a seconda del peso molecolare della proteina e il suo partner di legame, ma l'obiettivo è quello di determinare una quantità minima di proteina immobilizzata tcappello prevede (i) accettabile segnale-rumore per il legame cinetica con una bassa concentrazione del partner di legame (di seguito K D) e (ii) una distorsione minima di cinetica di legame con concentrazione quasi saturazione del partner di legame. Inoltre, stechiometria biotinilazione può variare (ma evitare> 1 mol biotina / proteine ​​mol), per cui alcuni dosaggio iniziale può essere necessario per ogni nuovo lotto di proteine ​​biotinilato per confermare che un segnale coerente BLI può essere raggiunto durante l'immobilizzazione sulla streptavidina-rivestito sensori.

Protocol

1. Programmare lo strumento per la BLI Assay Accendere lo strumento almeno un'ora di anticipo per permettere alla lampada di riscaldarsi, questo è necessario per minimizzare il rumore e la deriva in segnale ottico durante l'esperimento. Impostare la temperatura desiderata tramite la scheda strumento per preriscaldare il supporto piastra del campione. Quindi impostare il disegno sperimentale nel software di acquisizione dati. Selezionare "Nuovo Kinetics Experiment" nell…

Representative Results

Vincolante in tempo reale e la cinetica di dissociazione BLI sono mostrato in Figura 3. Questo esperimento è stato fatto con tampone di saggio in associazione e di dissociazione. Questo esperimento è stato avviato con una fase basale 10 min poiché i sensori sono stati prewet solo brevemente. Successivamente, ε biotinilato è stato caricato sui sensori. Nessuna dissociazione rilevabile di ε si è verificato in tutti i passaggi rimanenti come si è visto dalla curva di riferimento (G) che non aveva p…

Discussion

Strumenti attualmente disponibili per BLI permettono di throughput e di flessibilità nella saggi per interazioni biomolecolari. Vari campioni di soluzione vengono dispensati in pozzetti della micropiastra nero, e una serie di sensori BLI parallele sono programmati per muoversi avanti e indietro tra colonne di pozzetti sulla piastra. I campioni vengono mescolati agitando orbitale durante tutta la seduta. Il sistema utilizzato qui ha 8 sensori e utilizza una piastra campione di 96-bene, ma un altro sistema utilizza 16 se…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo FortéBio per fornire grafica utilizzata in Figura 1. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concedere GM083088 a TMD

Materials

Octet-RED96 Pall/FortéBio 30-5048
Bovine Serum Albumin Sigma A6003-10G Fatty Acid free
Biosensor/Streptavidin Pall/FortéBio 18-5019 Tray of 96 sensors
Microtiter plate Greiner Bio-one 655209 Black, Polypropylene
Data Acquisition software Pall/FortéBio Version 6.4 Newer versions available
Data Analysis software Pall/FortéBio Version 6.4 Newer versions available

References

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Cite This Article
Shah, N. B., Duncan, T. M. Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects. J. Vis. Exp. (84), e51383, doi:10.3791/51383 (2014).

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