Imaging inlc Secretion å etterforske Cellular Infeksjon av Bakteriell Patogen<em> Listeria monocytogenes</em

Den Gram positive bakterien Listeria monocytogenes er en matbåren patogen som invaderer vertsceller, forstyrrer dens intern vacuole og replikerer i cytoplasma av vertsceller ^en. L. monocytogenes enkel manipulasjon i laboratoriet sammenheng (rask vekst, lav toksisitet for friske individer) forbundet med utholdenhet av bakterielle virulens trekk observert i cellulære og dyremodeller (hemolytisk aktivitet, leukocytose) tillot sin opprinnelige bruk i 1960 som en viktig modell for studiet av intracellulære snylting og for etableringen av det teoretiske grunnlaget for cellulær immunitet mot infeksjon ^to. I slutten av 1980 og begynnelsen av 1990-tallet, disseksjon av bakterie intracellulær syklus ³ samt molekylær karakterisering av de viktigste bakteriell virulens faktorer ^4-7 favoriserte bruk av L. monocytogenes som en nøkkel molekylære verktøy for manipulasjon og study av vertcellefunksjonene. Tilstedeværelsen av avirulent (L. innocua) og virulente (L. monocytogenes) arter i Listeria slekten banet vei for komparative genomiske studiene ^åtte som sammen med den nylige etableringen av komplett V. monocytogenes transcriptome ^9, har økt vår forståelse av utviklingen av L. monocytogenes som et menneskelig patogen og som et modellsystem for infeksjonsstudier ^10.

L. monocytogenes induserer sin internalisering i vertsceller på samspillet mellom bakterielle overflateproteiner INLA og InlB med sine vertscellereseptorer E-cadherin og møtte henholdsvis ^11-12. Innledende kandidatbaserte undersøkelser førte til identifikasjon av α / β catenins-aktin kobling som en vesentlig komponent i INLA-invasjon veien ¹³ og for phosphoinositide 3-kinase (PI 3-K) som en kritisk effektor av InlB- avhengig invasjon cascade ^14-15. Proteomic og funksjonell-baserte analyser senere tillot identifisering av nye cytoskeletal elementene ¹⁶ og lipid andre budbringere ¹⁷ som kreves for vertscellen invasjon. Transkripsjons studier ¹⁸ og massespektrometri-baserte kvantitative proteomikk ¹⁹ har nylig kaste nytt lys om aktivering av verts signaliserer kaskader og undertrykkelse av immunresponser under L. monocytogenes infeksjon. Systembiologi tilnærminger basert på inaktivering av store sett av gener (kinomes, komplette genomer) av små interfererende RNA (siRNA) stanse har nylig åpnet nye veier for analyse av globale vert signale kaskader i sammenheng med spesifikke cellulære funksjoner, inkludert fagocytose og patogen intern ^20. Genome-wide siRNA-skjermer har tidligere blitt utført for å undersøke cellulære kaskader som kreves for infeksjon i L. monocytogenes i fagocyttisk Drosophila </em> S2 celler ^21-22, men denne typen analyser er ikke utført i ikke-fagocytiske celler, som representerer viktige mål for infeksjon in vivo.

Vi har optimalisert en protokoll for den mikroskopiske påvisning av sene stadier av infeksjon med L. monocytogenes som er egnet for high-throughput siRNA studier av bakteriell oppføring i epitelceller. Vår analyse tar nytte av en meget inngripende L. monocytogenes belastningen som presenterer et punkt mutasjon i PrfA, de store transcriptional regulator av L. monocytogenes virulens faktorer ^6: denne mutasjonen (oppkalt PrfA *) gjengir PrfA konstitutivt aktiv ²³ og fører til økt uttrykk av invasjonen proteiner INLA og InlB, derfor favorisere bakterie oppføring i ellers dårlig infiserte ikke-fagocyttiske celler. Vår avlesning for infeksjon er basert på påvisning av den cytosoliske oppsamling av det utskilte bakterieprotein inlc: dette molekylet eren pleiotropisk effector som uttrykkes fortrinnsvis ved intra-cytoplasmatisk L. monocytogenes ⁹ og som deltar ikke bare i bakteriell celle-til-celle spre ^24, men som også modulerer vert immunresponser ^25. Den fluorescerende merking av inlc sekresjon av intracellulære bakterier ikke bare gjør det mulig å klart skille infiserte fra ikke-infiserte celler, men representerer også et ende-punkt avlesning som kan benyttes til senere å dissekere infeksjon i sine forskjellige trinn: registrering, vacuolar flukt, cytosoliske bakteriell spredning og celle-til-celle-spredning. Denne mikros-basert protokoll kan bli koblet til siRNA skjermer således å studere cellulære baner som er involvert i infeksjonen av vertsceller av L. monocytogenes.