Визуализация InlC секрецию по расследованию сотовой инфекции по бактериальным патогеном<em> листерий</em
Summary
Листерий является грамположительных бактериальных патогенов часто используется в качестве основного модель для изучения внутриклеточного паразитизма. Визуализация поздно Л. моноцитогенес инфекции этапы в контексте малых вмешательства РНК экранов позволяет глобального исследования клеточных путей, необходимых для бактериальной инфекции клеток-хозяев целевых.
Abstract
Бактериальные внутриклеточные патогены можно рассматривать как молекулярных инструментов рассекать клеточные сигнальные каскады из-за их способности изысканно манипулировать и подорвать функции клеток, которые необходимы для заражения принимающих тканях-мишенях. Среди этих бактериальных патогенов, листерий является положительным микроорганизм грамм, который был использован в качестве парадигмы для внутриклеточного паразитизма в характеристике клеточного иммунного ответа, и которая сыграла инструментальные роли в открытии молекулярных путей, контролирующих динамику торговли людьми цитоскелета и мембраны. В этой статье мы опишем надежную микроскопическое анализа для обнаружения конце сотовой инфекции этапах L. моноцитогенес на основе флуоресцентного мечения InlC, секретируемого бактериального белка, который накапливается в цитоплазме инфицированных клеток; этот анализ может быть соединен с автоматизированным высокой пропускной малых интерферирующих РНК экранов, чтобы в угольacterize клеточные сигнальные пути, участвующие в до-или понижающей регуляции инфекции.
Introduction
Грамположительные бактерии листерий является пищевого происхождения возбудитель что поражает клетки-хозяева, нарушает его интернализации вакуоль и реплицируется в цитоплазме клетки-хозяева 1. L. моноцитогенес легкость манипуляции в лаборатории контексте (быстрый рост, низкой токсичностью для здоровых людей), связанных с сохранением бактериальных вирулентности черт, наблюдаемых в клеточных и животных моделях (гемолитическая активность, лейкоцитоз) позволил его первоначальное использование в 1960-х в качестве основного модели изучение внутриклеточной паразитизма и для создания теоретических основ клеточного иммунитета против инфекции 2. В конце 1980-х и начале 1990-х годов, рассечение бактериальной внутриклеточной цикла 3, а также молекулярной характеристике наиболее важных бактериальной факторов вирулентности 4-7 благоприятствовали использованию L. моноцитогенес как ключевой молекулярной инструмент для манипуляций и шпилькиу функций клеток-хозяев. Наличие авирулентного (Л. innocua) и сильнодействующие (L. моноцитогенес) видов в роду Listeria проложили путь для сравнительной геномной исследований 8, что, вместе с недавним созданием полного L. моноцитогенес транскриптома 9, увеличились наше понимание эволюции L. моноцитогенес как человека возбудителя и в качестве модельной системы для инфекции изучает 10.
L. моноцитогенес вызывает ее интернационализации в клетки-хозяева при взаимодействии бактериальных поверхностных белков INLA и InlB с их хозяин клеточных рецепторов E-кадгерина и встретился соответственно 11-12. Первоначальные кандидатов на основе исследования привели к идентификации α / β катенины-актина ссылку в качестве важного компонента INLA-путей инвазии 13 и части фосфоинозитидного 3-киназы (PI 3-К) в качестве важнейшего эффектора InlB- зависит вторжение Cascaде 14-15. Протеомные и функционально-основанные анализы впоследствии позволило идентификация новых цитоскелета элементов 16 и липидных вторичных мессенджеров 17, необходимых для вторжения клетки-хозяина. Транскрипции исследования 18 и масс-спектрометрии на основе количественная протеомика 19 недавно пролить новый свет относительно активации принимающих сигнальных каскадов и репрессий иммунных реакций во время L. моноцитогенес инфекции. Системная биология подходы на основе инактивации больших наборов генов (kinomes, полных геномов) по малых интерферирующих РНК (миРНК) молчание недавно открыли новые возможности для анализа глобальной хозяина сигнальных каскадов в контексте специфических клеточных функций, в том числе фагоцитоза и патоген интернализация 20. Генома экраны миРНК были ранее выполнены, чтобы исследовать клеточные каскады, необходимые для заражения L. моноцитогенес в фагоцитарной дрозофилы </eм> S2 клетки 21-22, но этот тип анализа не была выполнена в не-фагоцитов, которые представляют важные цели для инфекции в естественных условиях.
Мы оптимизировали протокол для микроскопического выявления поздних стадиях инфекции L. моноцитогенес, который подходит для высокой пропускной миРНК исследований бактериальной вступления в эпителиальных клетках. Наш анализ использует высоко инвазивной L. моноцитогенес штамм, который представляет точечную мутацию в PrfA, основным регулятором транскрипции Л. моноцитогенес факторов вирулентности 6: эта мутация (названный PrfA *) оказывает PrfA постоянно активный 23 и приводит к повышенной экспрессии вторжения белков INLA и InlB, поэтому в пользу бактериальной запись в противном случае плохо инфицированных не-фагоцитов. Наша считывания для инфекции основано на обнаружении цитозольной накопления секретируемого белка бактериальной InlC: эта молекулаплейотропным эффектор, который выражается преимущественно внутри-цитоплазматической L. моноцитогенес 9 и которые не только участвует в бактериальной клетке клетки к распространяться 24, но которые также модулирует иммунного ответа 25. Флуоресцентный маркировка секреции InlC по внутриклеточных бактерий позволяет не только четко различать зараженными от неинфицированных клеток, но также представляет собой конечной точки считывания, который можно использовать в последующем рассекать инфекции в его различных этапов: вход, вакуолярной бежать, цитозольного бактериальной распространение и распространение от клетки к клетке. Этот протокол на основе микроскопии может быть соединен с экранами миРНК поэтому для изучения клеточных путей, участвующих в инфекции клеток-хозяев Л. моноцитогенес.
Protocol
Representative Results
Discussion
Некоторые параметры имеют решающее значение для успеха нашего протокола InlC обнаружения, в том числе с использованием здоровых клеточных линий, отображающих достаточно большое цитоплазму, чтобы позволить однозначную обнаружение сигнала InlC. В анализе мы представляем в этой статье мы п…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследования в П. Cossart лаборатории поддерживается Институтом Пастера, Национальным институтом де-ла-Здоровье и де ла Recherche Medicale, Национальным институтом де-ла-Recherche агрономических, ERC Advanced Грант (233348), Национальное агентство по де-ла-Recherche (грант MIE- SignRupVac), Луи-Jeantet фонд и Фонд Ле Рош Les Mousquetaires. АК является получателем стипендии от Пастер-Париж университет международных докторской программы / Institut Карно болезней Infectieuses. Мы благодарим Джейсон Мерсер для оптимизации протокола сотовой трансфекции.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Bacto Brain Heart Infusion | BD | 237500 | For liquid BHI preparation |
| Bacto Agar | BD | 214010 | Supplement to liquid BHI for BHI agar plates |
| Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum | Biowest | 51830-500 | |
| DMEM | Invitrogen | 61965-026 | |
| Lipofectamine RNAiMax | Invitrogen | 13778-100 | |
| Gentamicin | Sigma | G1397-10ML | |
| Formaldehyde (16%) | EMS | 15710 | Prepare fresh before each experiment |
| Anti-Rabbit Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A-11035 | |
| DAPI | Invitrogen | D-1306 | |
| Phalloidin Dy647 | Dyomics | 647-33 | |
| siRNA Scramble | Dharmacon | D-001810-10 | |
| siRNA Met | Dharmacon | L-003156-00-0005 | |
| Black 384-well microscopy cell culture plate | Corning | 3985 | |
| AxioObserver Z1 microscope | Zeiss | 431007 9901 | |
| sCMOS camera | Andor | Neo | |
| Metamorph analysis software | Molecular Devices | 4000 | |
| CellProfiler analysis software | Broad Institute | Public software available at http://www.cellprofiler.org/ |
References
- Pizarro-Cerdá, J., Kühbacher, A., Cossart, P. Entry of Listeria monocytogenes in mammalian epithelial cells: an updated view. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2, 1-17 (2012).
- Mackaness, G. B. Cellular resistance to infection. Journal of Experimental Medicine. 116, 381-406 (1962).
- Tilney, L. G., Portnoy, D. A. Actin filaments and the growth, movement, and spread of the intracellular bacterial parasite, Listeria monocytogenes. Journal of Cell Biology. 109, 1597-1608 (1989).
- Mengaud, J., Chenevert, J., Geoffroy, C., Gaillard, J. L., Cossart, P. Identification of the structural gene encoding the SH-activated hemolysin of Listeria monocytogenes: listeriolysin O is homologous to streptolysin O and pneumolysin. Infection and Immunity. 55, 3225-3227 (1987).
- Gaillard, J. L., Berche, P., Frehel, C., Gouin, E., Cossart, P. Entry of L. monocytogenes into cells is mediated by internalin, a repeat protein reminiscent of surface antigens from gram-positive cocci. Cell. 65, 1127-1141 (1991).
- Mengaud, J., Dramsi, S., Gouin, E., Vazquez-Boland, J. A., Milon, G., Cossart, P. Pleiotropic control of Listeria monocytogenes virulence factors by a gene that is autoregulated. Molecular Microbiology. 5, 2273-2283 (1991).
- Kocks, C., Gouin, E., Tabouret, M., Berche, P., Ohayon, H., Cossart, P. L. monocytogenes-induced actin assembly requires the actA gene product, a surface protein. Cell. 68, 521-52 (1992).
- Glaser, P., et al. Comparative genomics of Listeria species. Science. 294, 849-852 (2001).
- Toledo-Arana, A., et al. The Listeria transcriptional landscape: from saprophytism to virulence. Nature. 459, 950-956 (2009).
- Cossart, P. Illuminating the landscape of host-pathogen interactions with the bacterium Listeria monocytogenes. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19484-19491 (1073).
- Mengaud, J., Ohayon, H., Gounon, P., Mege, R. -. M., Cossart, P. E-cadherin is the receptor for internalin, a surface protein required for entry of L. monocytogenes into epithelial cells. Cell. 84, 923-932 (1996).
- Shen, Y., Naujokas, M., Park, M., Ireton, K. InIB-dependent internalization of Listeria is mediated by the Met receptor tyrosine kinase. Cell. 103, 501-510 (2000).
- Lecuit, M., Hurme, R., Pizarro-Cerda, J., Ohayon, H., Geiger, B., Cossart, P. A role for alpha-and beta-catenins in bacterial uptake. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97, 10008-10013 (2000).
- Ireton, K., et al. A role for phosphoinositide 3-kinase in bacterial invasion. Science. 274, 780-782 (1996).
- Ireton, K., Payrastre, B., Cossart, P. The Listeria monocytogenes protein InlB is an agonist of mammalian phosphoinositide 3-kinase. Journal of Biological Chemistry. 274, 17025-17032 (1999).
- Pizarro-Cerdá, J., Jonquières, R., Gouin, E., Vandekerckhove, J., Garin, J., Cossart, P. Distinct protein patterns associated with Listeria monocytogenes InlA- or InlB phagosomes. Cellular Microbiology. 4, 101-115 (2002).
- Pizarro-Cerdá, J., Payrastre, B., Wang, Y. -. J., Veiga, E., Yin, H. L., Cossart, P. Type II phosphatidylinositol 4-kinases promote Listeria monocytogenes entry into target cells. Cellular Microbiology. 9, 2381-2390 (2007).
- Hamon, M. A., et al. Histone modifications induced by a family of bacterial toxins. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 104, 17555-17559 (2007).
- Ribet, D., et al. Listeria monocytogenes impairs SUMOylation for efficient infection. Nature. 464, 1192-1195 (2010).
- Rämet, M., Manfruelli, P., Pearson, A., Mathey-Prevot, B., Ezekowitz, R. A. Functional genomic analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli. Nature. 416, 644-648 (2002).
- Agaisse, H., Burrack, L. S., Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N., Higgins, D. E. Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection. Science. 309, 1248-1251 (2005).
- Cheng, L. W., Viala, J. P., Stuurman, N., Wiedemann, U., Vale, R. D., Portnoy, D. A. Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102, 13646-13651 (2005).
- Ripio, M. T., Domínguez-Bernal, G., Lara, M., Suárez, M., Vazquez-Boland, J. A. A Gly145Ser substitution in the transcriptional activator PrfA causes constitutive overexpression of virulence factors in Listeria monocytogenes. Journal of Bacteriology. 179, 1533-1540 (1997).
- Rajabian, T., et al. The bacterial virulence factor InlC perturbs apical cell junctions and promotes cell-to-cell spread of Listeria. Nature Cell Biology. 11, 1212-1218 (2009).
- Gouin, E., et al. The Listeria monocytogenes InlC protein interferes with innate immune responses by targeting the IκB kinase subinit IKKα. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107, 17333-17338 (2010).
- Pizarro-Cerdá, J., Lecuit, M., Cossart, P. Measuring and analysing invasion of mammalian cells by bacterial pathogens: the Listeria monocytogenes system. Methods in Molecular Microbiology. 31, 161-177 (2002).
- Snijder, B., Sacher, R., Rämö, P., Damm, E. M., Liberali, P., Pelkmans, L. Population context determines cell-to-cell variability in endocytosis and virus infection. Nature. 461, 520-523 (2009).
