Summary

ההדמיה InlC הפרשה לחקר זיהום נייד על ידי פתוגן החיידקים<em> חיידקי ליסטריה</em

Published: September 19, 2013
doi:

Summary

חיידקי ליסטריה הוא פתוגן חיידקים גראם חיובי משמש לעתים קרובות כמודל עיקרי לחקר טפילות תאית. הדמיה מאוחר L. חיידקי לשלבי זיהום בהקשר של מסכי RNA התערבות קטנים מאפשר למחקר העולמי של מסלולים הסלולר נדרשים לזיהום חיידקים של תאי מארח יעד.

Abstract

ניתן לתפוס פתוגנים תאיים חיידקים ככלים מולקולריים לנתח מפלי איתות הסלולר בשל יכולתם לתמרן להפליא ולחתור תחת פונקציות תא הנדרשות להדבקת רקמות יעד מארח. בין החיידקים פתוגנים אלה, חיידקי ליסטריה הוא מיקרואורגניזם גראם חיובי ששמש כפרדיגמה לטפילות תאית באפיון של תגובה חיסונית תאית, ואשר מילאו תפקידים מרכזיים בגילוי מסלולים המולקולריים שליטה דינמיקת סחר cytoskeletal וקרום. במאמר זה, אנו מתארים assay Microscopical חזק לצורך זיהוי של שלבים מאוחרים של זיהום סלולארי L. חיידקי המבוססים על תיוג הניאון של InlC, חלבון מופרש חיידקים שמצטבר בציטופלסמה של תאים נגועים; assay זה יכול להיות בשילוב למסכים אוטומטיים תפוקה גבוהה קטנים מפריעים RNA כדי להשחירacterize מסלולי איתות תאיים מעורבים בוויסות מעלה מטה או לזיהום.

Introduction

החיידק גראם החיובי חיידקי ליסטריה הוא פתוגן שמקורן במזון שפולש לתאי מארח, משבש vacuole ההפנמה ומשכפל בציטופלסמה של תאי מארח 1. L. חיידקי הקלות של מניפולציה בהקשר המעבדה (צמיחה מהירה, הרעילות נמוכה לאנשים בריאים) קשור עם ההתמדה של תכונות ארסיות חיידקים שנצפו בדגמים סלולריים ובעלי חיים (פעילות המוליטית, ריבוי תאי דם לבנים) התירו השימוש הראשוני שלה ב1960s כמודל עיקרי ל המחקר של טפילות תאית ולהקמתן של היסודות התיאורטיים של חסינות הסלולר נגד זיהום 2. בסוף 1980s ותחילת 1990, הנתיחה של מחזור החיידקים תאיים 3, כמו גם האפיון המולקולרי של ארסי חיידקי גורמים החשובים ביותר 4-7 העדיף את השימוש של L. חיידקי ככלי מולקולרי מרכזי למניפולציה וגם החתיךy של פונקציות תא מארחות. נוכחותם של לא אלים (innocua ל ') ומינים ארסיים (חיידקי L.) בסוג ליסטריה סללו את הדרך למחקרים גנומית השוואתיים 8 זה, יחד עם ההקמה האחרונה של L. המלא חיידקי transcriptome 9, גדלו ההבנה של האבולוציה שלנו ל ' חיידקי כהפתוגן אנושי וכמערכת מודל לזיהום לומדים 10.

חיידקי L. גורם הפנמתו לתוך תאי מארח על אינטראקציה של חלבוני פני השטח של חיידקי InlA וInlB עם קולטני תא המארח שלהם E-cadherin והמטרופוליטן, בהתאמה 11-12. מחקרים מבוססי מועמד ראשוניים הובילו לזיהוי של הקישור catenins-אקטין α / β כמרכיב משמעותי של מסלול InlA פלישת 13 ושל phosphoinositide 3-קינאז (PI 3-K) כמפעיל קריטי של InlB- casca פלישה תלויהדה 14-15. מבחני proteomic ומבוססי פונקציונליים אפשרו לאחר מכן את זיהוי של גורמי רומן cytoskeletal 16 ושליחים שני שומנים 17 דרושים לפלישת תא מארח. מחקרי תעתיק 18 ופרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית המסה כמותית 19 לאחרונה שופכים אור חדש בנוגע להפעלה של מפלי מארח איתות והדיכוי של מערכת החיסונית במהלך L. חיידקי לזיהום. ביולוגיה של מערכות המבוססת על גישות איון של קבוצות גדולות של גנים (kinomes, הגנום מלא) על ידי RNA התערבות קטן השתקה (siRNA) לאחרונה פתחה אפיקים חדשים לניתוח המארח הגלובלי איתות מפלים בהקשר של תפקודים תאיים ספציפיים, כולל phagocytosis ו הפנמת הפתוגן 20. מסכי siRNA הגנום כבר בוצעו בעבר לחקור מפלים סלולריים הנדרשים לזיהום של L. חיידקי בדרוזופילה phagocytic </eמ '> תאי S2 21-22, אבל זה סוג של ניתוח לא שבוצע בתאים שאינם phagocytic, המייצגים מטרות קריטיות לזיהום בגוף חי.

יש לנו אופטימיזציה פרוטוקול לזיהוי Microscopical של שלבים מאוחרים של זיהום על ידי ל חיידקי שמתאימים ללימודי siRNA תפוקה גבוהה של כניסת חיידקים בתוך תאי אפיתל. assay שלנו מנצל L. פולשני מאוד חיידקי לזן שמציג מוטציה נקודתית בPrfA, רגולטור תעתיק העיקרי של L. חיידקי ארסי גורמי 6: מוטציה זו (בשם PrfA *) הופכת PrfA פעיל 23 constitutively ומובילה לביטוי מוגבר של חלבוני פלישת InlA וInlB, ולכן העדפת כניסת חיידקים בתאים שאינם phagocytic אחרת גרוע נגועים. קריאת הנתונים שלנו לזיהום מבוסס על זיהוי של הצטברות cytosolic של InlC חלבון החיידקים המופרש: מולקולה זו היאמפעיל pleiotropic שבא לידי ביטוי באופן מועדף על ידי ל 'התוך cytoplasmic חיידקי 9 ובו משתתף לא רק בתא תא אל החיידקים להתפשט 24 אך גם מודולציה תגובות חיסונית מארח 25. ניאון התיוג של הפרשת InlC ידי חיידקים תאיים לא רק מאפשר להבחין נגוע מהתאים שאינם נגועים באופן ברור, אלא גם מייצג readout נקודת סיום שיכול לשמש כדי לנתח לאחר מכן זיהום בשלבים השונים שלה: כניסה, בריחת vacuolar, חיידקי cytosolic ריבוי והתפשטות תא אל התא. פרוטוקול מבוסס מיקרוסקופיה זה יכול להיות בשילוב למסכי siRNA לכן ללמוד מסלולי הסלולר מעורבים בזיהום של תאי מארח של ל ' חיידקי.

Protocol

1. תרבויות הכנת נייד וחיידקיים, כלים Transfection ונוגדנים ראשוניים הכן צלחת אגר טרי לבודד ל בודד חיידקי ממושבות חיידקי מניית גליצרול (50% glycerol/50% רוויים תרבות לילה נוזלית חיידקים) המשיכו ב -80 ° C. <ol style=";text-align:right;direction…

Representative Results

ניאון תיוג של InlC cytoplasmic מספק readout חזק לזיהום תא על ידי ל ' חיידקי, כפי שמודגמים באיור 1: התא המרכזי במיקרוסקופ נגוע מאוד על ידי זן P14.PrfA * 23 כפי שניתן לראות בתמונה בניגוד השלב (ראשי חץ, איור 1 א) והוא אושר על ידי אות DAPI בי חיידקים בודדים ניתן לה?…

Discussion

מספר פרמטרים הם קריטיים להצלחתו של פרוטוקול InlC איתור שלנו, כוללים השימוש בשורות תאים בריאים מוצגות ציטופלסמה גדולה מספיק כדי לאפשר זיהוי חד משמעי של אות InlC. ב assay אנו מציגים במאמר זה אנו מציעים את השימוש בתאי הלה CCL2, שהם גם מתאימים במיוחד עבור assay שלנו בעקבות ההארכה של …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר במעבדה פ Cossart נתמך על ידי מכון פסטר, Institut National de la סנטה et de la משוכלל ונדיר Médicale, Institut National de la משוכלל ונדיר Agronomique, ERC Advanced Grant (233,348), Nationale de la משוכלל ונדיר סוכנות הידיעות (גרנט מ.י.- SignRupVac), קרן לואי ז'נטה וFondation Le Roch Les Mousquetaires. AK הוא נמען של מלגה מInfectieuses פסטר בפריז הבינלאומית באוניברסיטה לתואר השלישי תכנית / Institut החוליים קרנו. אנו מודים ג'ייסון מרסר לייעול פרוטוקול transfection הסלולרי.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Bacto Brain Heart Infusion BD 237500 For liquid BHI preparation
Bacto Agar BD 214010 Supplement to liquid BHI for BHI agar plates
Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum Biowest 51830-500
DMEM Invitrogen 61965-026
Lipofectamine RNAiMax Invitrogen 13778-100
Gentamicin Sigma G1397-10ML
Formaldehyde (16%) EMS 15710 Prepare fresh before each experiment
Anti-Rabbit Alexa Fluor 546 Invitrogen A-11035
DAPI Invitrogen D-1306
Phalloidin Dy647 Dyomics 647-33
siRNA Scramble Dharmacon D-001810-10
siRNA Met Dharmacon L-003156-00-0005
Black 384-well microscopy cell culture plate Corning 3985
AxioObserver Z1 microscope Zeiss 431007 9901
sCMOS camera Andor Neo
Metamorph analysis software Molecular Devices 4000
CellProfiler analysis software Broad Institute Public software available at http://www.cellprofiler.org/

References

  1. Pizarro-Cerdá, J., Kühbacher, A., Cossart, P. Entry of Listeria monocytogenes in mammalian epithelial cells: an updated view. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2, 1-17 (2012).
  2. Mackaness, G. B. Cellular resistance to infection. Journal of Experimental Medicine. 116, 381-406 (1962).
  3. Tilney, L. G., Portnoy, D. A. Actin filaments and the growth, movement, and spread of the intracellular bacterial parasite, Listeria monocytogenes. Journal of Cell Biology. 109, 1597-1608 (1989).
  4. Mengaud, J., Chenevert, J., Geoffroy, C., Gaillard, J. L., Cossart, P. Identification of the structural gene encoding the SH-activated hemolysin of Listeria monocytogenes: listeriolysin O is homologous to streptolysin O and pneumolysin. Infection and Immunity. 55, 3225-3227 (1987).
  5. Gaillard, J. L., Berche, P., Frehel, C., Gouin, E., Cossart, P. Entry of L. monocytogenes into cells is mediated by internalin, a repeat protein reminiscent of surface antigens from gram-positive cocci. Cell. 65, 1127-1141 (1991).
  6. Mengaud, J., Dramsi, S., Gouin, E., Vazquez-Boland, J. A., Milon, G., Cossart, P. Pleiotropic control of Listeria monocytogenes virulence factors by a gene that is autoregulated. Molecular Microbiology. 5, 2273-2283 (1991).
  7. Kocks, C., Gouin, E., Tabouret, M., Berche, P., Ohayon, H., Cossart, P. L. monocytogenes-induced actin assembly requires the actA gene product, a surface protein. Cell. 68, 521-52 (1992).
  8. Glaser, P., et al. Comparative genomics of Listeria species. Science. 294, 849-852 (2001).
  9. Toledo-Arana, A., et al. The Listeria transcriptional landscape: from saprophytism to virulence. Nature. 459, 950-956 (2009).
  10. Cossart, P. Illuminating the landscape of host-pathogen interactions with the bacterium Listeria monocytogenes. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19484-19491 (1073).
  11. Mengaud, J., Ohayon, H., Gounon, P., Mege, R. -. M., Cossart, P. E-cadherin is the receptor for internalin, a surface protein required for entry of L. monocytogenes into epithelial cells. Cell. 84, 923-932 (1996).
  12. Shen, Y., Naujokas, M., Park, M., Ireton, K. InIB-dependent internalization of Listeria is mediated by the Met receptor tyrosine kinase. Cell. 103, 501-510 (2000).
  13. Lecuit, M., Hurme, R., Pizarro-Cerda, J., Ohayon, H., Geiger, B., Cossart, P. A role for alpha-and beta-catenins in bacterial uptake. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97, 10008-10013 (2000).
  14. Ireton, K., et al. A role for phosphoinositide 3-kinase in bacterial invasion. Science. 274, 780-782 (1996).
  15. Ireton, K., Payrastre, B., Cossart, P. The Listeria monocytogenes protein InlB is an agonist of mammalian phosphoinositide 3-kinase. Journal of Biological Chemistry. 274, 17025-17032 (1999).
  16. Pizarro-Cerdá, J., Jonquières, R., Gouin, E., Vandekerckhove, J., Garin, J., Cossart, P. Distinct protein patterns associated with Listeria monocytogenes InlA- or InlB phagosomes. Cellular Microbiology. 4, 101-115 (2002).
  17. Pizarro-Cerdá, J., Payrastre, B., Wang, Y. -. J., Veiga, E., Yin, H. L., Cossart, P. Type II phosphatidylinositol 4-kinases promote Listeria monocytogenes entry into target cells. Cellular Microbiology. 9, 2381-2390 (2007).
  18. Hamon, M. A., et al. Histone modifications induced by a family of bacterial toxins. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 104, 17555-17559 (2007).
  19. Ribet, D., et al. Listeria monocytogenes impairs SUMOylation for efficient infection. Nature. 464, 1192-1195 (2010).
  20. Rämet, M., Manfruelli, P., Pearson, A., Mathey-Prevot, B., Ezekowitz, R. A. Functional genomic analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli. Nature. 416, 644-648 (2002).
  21. Agaisse, H., Burrack, L. S., Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N., Higgins, D. E. Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection. Science. 309, 1248-1251 (2005).
  22. Cheng, L. W., Viala, J. P., Stuurman, N., Wiedemann, U., Vale, R. D., Portnoy, D. A. Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102, 13646-13651 (2005).
  23. Ripio, M. T., Domínguez-Bernal, G., Lara, M., Suárez, M., Vazquez-Boland, J. A. A Gly145Ser substitution in the transcriptional activator PrfA causes constitutive overexpression of virulence factors in Listeria monocytogenes. Journal of Bacteriology. 179, 1533-1540 (1997).
  24. Rajabian, T., et al. The bacterial virulence factor InlC perturbs apical cell junctions and promotes cell-to-cell spread of Listeria. Nature Cell Biology. 11, 1212-1218 (2009).
  25. Gouin, E., et al. The Listeria monocytogenes InlC protein interferes with innate immune responses by targeting the IκB kinase subinit IKKα. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107, 17333-17338 (2010).
  26. Pizarro-Cerdá, J., Lecuit, M., Cossart, P. Measuring and analysing invasion of mammalian cells by bacterial pathogens: the Listeria monocytogenes system. Methods in Molecular Microbiology. 31, 161-177 (2002).
  27. Snijder, B., Sacher, R., Rämö, P., Damm, E. M., Liberali, P., Pelkmans, L. Population context determines cell-to-cell variability in endocytosis and virus infection. Nature. 461, 520-523 (2009).

Play Video

Cite This Article
Kühbacher, A., Gouin, E., Mercer, J., Emmenlauer, M., Dehio, C., Cossart, P., Pizarro-Cerdá, J. Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes. J. Vis. Exp. (79), e51043, doi:10.3791/51043 (2013).

View Video