Imagerie RICL sécrétion d'enquêter sur l'infection cellulaire par le pathogène bactérien<em> Listeria monocytogenes</em

La bactérie à Gram positif Listeria monocytogenes est un agent pathogène d'origine alimentaire qui envahit les cellules de l'hôte, perturbe sa vacuole d'internalisation et se réplique dans le cytoplasme des cellules hôtes ^1. L. monocytogenes facilité de manipulation dans le contexte de laboratoire (d'une croissance rapide, une faible toxicité pour les individus en bonne santé) associée à la persistance de caractéristiques de virulence bactériennes observées dans des modèles cellulaires et animaux (l'activité hémolytique, leucocytose) a permis son utilisation initiale dans les années 1960 comme un modèle majeur pour l'étude du parasitisme intracellulaire et pour la mise en place des fondements théoriques de l'immunité cellulaire contre l'infection ^2. À la fin des années 1980 et au début des années 1990, la dissection du cycle intracellulaire bactérienne ³ ainsi que la caractérisation moléculaire de la virulence bactérienne la plus importante facteurs ^4-7 favorisé l'utilisation de L. monocytogenes comme un outil moléculaire clé pour la manipulation et le goujony des fonctions de la cellule hôte. La présence de non virulente (L. innocua) et (L. monocytogenes) espèces virulentes dans le genre Listeria ont ouvert la voie à des études génomiques comparatives ⁸ qui, avec la création récente de la L. complète monocytogenes transcriptome ^9, ont accru notre compréhension de l'évolution de L. monocytogenes comme un agent pathogène humain et en tant que système modèle pour l'infection études de ^10.

L. monocytogenes induit son internalisation dans les cellules hôtes lors de l'interaction des protéines de surface bactériennes INLA et INLB avec leurs récepteurs de la cellule hôte E-cadhérine et Met, respectivement ^11-12. Études sur la base de candidats initiaux ont conduit à l'identification de l'α / β caténines-actine lien comme une composante importante de la voie InlA-invasion ¹³ et de la phosphoinositide 3-kinase (PI 3-K) comme un effecteur critique de la InlB- dépendant invasion cascade ^{14 à 15.} Analyses protéomiques et base fonctionnelle suite ont permis d'identifier de nouveaux éléments du cytosquelette et ¹⁶ seconds messagers lipidiques ¹⁷ requis pour l'invasion de la cellule hôte. Études de la transcription ¹⁸ et protéomique de masse basé spectrométrie de ¹⁹ quantitatives ont récemment jeté un nouvel éclairage sur l'activation de la signalisation accueil cascades et la répression de la réponse immunitaire au cours de L. monocytogenes infection. Biologie systémique basée sur l'inactivation des grands ensembles de gènes (kinomes, génomes complets) par petits ARN interférents (siRNA) silencieux ont récemment ouvert de nouvelles voies pour l'analyse de l'hôte mondiale cascades de signalisation dans le cadre des fonctions cellulaires spécifiques, y compris la phagocytose et pathogène internalisation ^20. Écrans de siRNA du génome entier ont déjà été menées pour examiner cascades cellulaires nécessaires pour l'infection de L. monocytogenes dans phagocytaire Drosophila </em> cellules S2 ^21-22, mais ce type d'analyse n'a pas été réalisée dans des cellules non-phagocytaires, qui représentent des cibles importantes pour l'infection in vivo.

Nous avons optimisé un protocole pour la détection microscopique des stades tardifs de l'infection par L. monocytogenes qui est adapté pour les études à haut débit siARN d'entrée bactérienne dans les cellules épithéliales. Notre essai tire parti d'un L. hautement invasive monocytogenes souche qui présente une mutation ponctuelle dans PrfA, le régulateur transcriptionnel majeur de L. monocytogenes facteurs de virulence ^6: cette mutation (nommé PrfA *) rend PrfA constitutivement active ²³ et conduit à une augmentation de l'expression des protéines d'invasion de l'INLA et INLB, favorisant ainsi l'entrée des bactéries dans les cellules non-phagocytaires sinon mal infectés. Notre lecture de l'infection est basé sur la détection de l'accumulation cytosolique de la sécrétée de la protéine bactérienne RICL: cette molécule estun effecteur pleiotrope qui s'exprime préférentiellement par voie intra-cytoplasmique L. ⁹ monocytogenes et qui participe non seulement à la cellule-cellule au-bactérien réparties ²⁴ mais qui modulent également les réponses immunitaires de l'hôte ^25. Le marquage fluorescent des RICL la sécrétion par les bactéries intracellulaires non seulement permet de distinguer clairement infectée à partir de cellules non infectées, mais représente également une lecture du point final qui peut être utilisé par la suite pour disséquer infection dans ses différentes étapes: d'entrée, évasion vacuolaire, bactérienne cytosolique la prolifération et la propagation de cellule à cellule. Ce protocole basé sur la microscopie peut être couplé à écrans siARN donc d'étudier les voies cellulaires impliquées dans l'infection des cellules hôtes par L. monocytogenes.