Summary

Beeldvorming InlC Afscheiding to Cellular Infectie Onderzoek door de bacteriële pathogenen<em> Listeria monocytogenes</em

Published: September 19, 2013
doi:

Summary

Listeria monocytogenes is een Gram-positieve bacteriële pathogenen vaak gebruikt als een belangrijk model voor de studie van intracellulaire parasieten. Beeldvorming laat L. monocytogenes infectie fasen in het kader van kleine interfererende RNA schermen maakt de globale studie van cellulaire mechanismen vereist voor bacteriële infectie van target gastheercellen.

Abstract

Bacteriële intracellulaire pathogenen kan worden opgevat als moleculaire technieken om cellulaire signaaltransductie cascades vanwege hun vermogen om prachtig te manipuleren en te ondermijnen cel functies die nodig zijn voor de infectie van gastheer doelwitweefsels ontleden. Onder deze bacteriële pathogenen, Listeria monocytogenes is een Gram-positieve micro-organisme, dat is gebruikt als een paradigma voor intracellulaire parasitisme in de karakterisering van cellulaire immuunrespons, en die instrumentele rol heeft gespeeld bij de ontdekking van de moleculaire pathways cytoskelet en membraantransport dynamiek beheersen van. In dit artikel beschrijven we een robuuste microscopische test voor de detectie van cellulaire infectie late stadia van L. monocytogenes basis van de fluorescente labeling van InlC, een uitgescheiden bacteriële eiwit dat accumuleert in het cytoplasma van geïnfecteerde cellen, deze assay kan worden gekoppeld met geautomatiseerde high-throughput kleine interfererende RNA schermen om characterize cellulaire signaalwegen betrokken bij het up-of down-regulatie van infectie.

Introduction

De Gram positieve bacterie Listeria monocytogenes is een voedsel overgedragen pathogeen dat gastheercellen valt, verstoort de internalisatie vacuole en repliceert in het cytoplasma van gastheercellen 1. L. monocytogenes gemak van manipulatie in het laboratorium context (snelle groei, een lage toxiciteit voor gezonde personen) in verband met het voortbestaan ​​van bacteriële virulentie eigenschappen waargenomen in cellulaire en diermodellen (hemolytische activiteit, leukocytose) toegestaan ​​het eerste gebruik in de jaren 1960 als een belangrijk model voor de studie van intracellulaire parasitisme en voor de oprichting van de theoretische grondslagen van cellulaire immuniteit tegen infectie 2. In de late jaren 1980 en begin jaren 1990, de ontleding van de intracellulaire bacteriële cyclus 3 en de moleculaire karakterisatie van de belangrijkste bacteriële virulentiefactoren 4-7 voorkeur het gebruik van L. monocytogenes als een belangrijke moleculaire tool voor de manipulatie en study gastheercel functies. De aanwezigheid van avirulent (L. innocua) en virulente (L. monocytogenes) soorten in het geslacht Listeria de weg vrijgemaakt voor comparative genomic studies 8 die, samen met de recente oprichting van de volledige L. monocytogenes Transcriptome 9, ons begrip van de evolutie van L. zijn toegenomen monocytogenes als een menselijk pathogeen en als een modelsysteem voor infectie studies 10.

L. monocytogenes induceert de internalisatie in gastheercellen na interactie van de bacteriële oppervlakte-eiwitten sture en InlB met hun gastheercel receptoren E-cadherine en Met respectievelijk 11-12. Eerste-kandidaat gebaseerde studies leidden tot de identificatie van de α / β-actine catenins verbinding als een belangrijk onderdeel van de inla-invasie route 13 en de fosfoinositide 3-kinase (PI3-K) als een kritische effector van InlB- afhankelijke invasie Cascade 14-15. Proteomics en functionele assays op basis daarna kon de identificatie van nieuwe cytoskelet elementen 16 en lipide second messengers 17 vereist gastheercel invasie. Transcriptionele studies 18 en massa-spectrometrie gebaseerde kwantitatieve proteomics 19 hebben onlangs een nieuw licht werpen met betrekking tot de activering van gastheer signaleringscascades en de onderdrukking van de immuunrespons tijdens L. monocytogenes infectie. Systeembiologie aanpak gebaseerd op de inactivatie van grote sets van genen (kinomes, complete genomen) door kleine interfererende RNA (siRNA) silencing hebben onlangs nieuwe wegen geopend voor de analyse van de wereldwijde gastheer signaleringscascades in het kader van specifieke cellulaire functies, met inbegrip van fagocytose en pathogeen internalisatie 20. Genoom-brede siRNA schermen zijn eerder uitgevoerd om cellulaire cascades die nodig zijn voor infectie van L. onderzoeken monocytogenes in fagocytaire Drosophila </em> S2 cellen 21-22, maar dit type analyse is niet uitgevoerd in niet-fagocytische cellen, die kritisch doelstellingen voor infectie in vivo vertegenwoordigen.

We hebben een protocol geoptimaliseerd voor de microscopische detectie van late stadia van de infectie door L. monocytogenes die geschikt is voor hoge-doorvoer siRNA studies van bacteriële binnenkomst epitheelcellen. Onze test maakt gebruik van een zeer invasieve L. monocytogenes-stam die een puntmutatie in PRFA, de belangrijkste transcriptionele regulator van L. presenteert monocytogenes virulentiefactoren 6: deze mutatie (genaamd PRFA *) maakt PRFA constitutief actief 23 en leidt tot een verhoogde expressie van de invasie eiwitten ing en InlB derhalve de voorkeur bacteriële binnenkomst in zich moeilijk geïnfecteerde niet-fagocytische cellen. De uitlezing voor infectie is gebaseerd op de detectie van de cytosolische accumulatie van de uitgescheiden bacteriële eiwitten InlC: Dit molecuuleen pleiotroop effector die bij voorkeur wordt uitgedrukt door intracytoplasmatische L. monocytogenes 9 en die participeert niet alleen in de bacteriële cel-cel verspreiding 24 maar ook moduleert gastheer immuunreacties 25. De fluorescente labeling van InlC secretie door intracellulaire bacteriën kan niet alleen duidelijk onderscheid geïnfecteerde van niet-geïnfecteerde cellen, maar vertegenwoordigt een eindpunt uitlezing die gebruikt kan worden om vervolgens ontleden infectie bij de verschillende stappen: ingang, vacuolaire ontsnappen, cytosolische bacteriële proliferatie en cel-naar-cel verspreiding. Deze microscopie protocol kan worden gekoppeld met siRNA schermen derhalve cellulaire routes betrokken bij de infectie van gastheercellen door L. bestuderen monocytogenes.

Protocol

1. Voorbereiding van Cellulaire en bacterieculturen, Transfection Gereedschap en Primaire antilichamen Bereid een frisse agar plaat te isoleren individuele L. monocytogenes kolonies van een bacteriële glycerol voorraad (50% glycerol/50% verzadigd bacteriële vloeibare overnachtkweek) bewaard bij -80 ° C. Met een aluminium rek (bij -80 ° C gehouden) een bacteriële bevroren glycerolvoorraad, strook bacteriën op Brain Heart Infusion (BHI) agar plaat vervoeren. Incubeer de plaat b…

Representative Results

Fluorescentielabelling van cytoplasmatische InlC biedt een robuuste uitlezing voor cel infectie door L. monocytogenes, zoals in figuur 1: de centrale cel in de microfoto is sterk besmet door de stam P14.PrfA * 23 zoals kan worden waargenomen in fase contrast beeld (pijlpunten figuur 1A) en wordt bevestigd door de DAPI signaal waar individuele bacteriën duidelijk onderscheiden (Figuur 1B). De InlC kleuring (gesuperponeerd op de DAPI kleuring in figuu…

Discussion

Verschillende parameters zijn cruciaal voor het succes van onze InlC detectie protocol, inclusief het gebruik van gezonde cellijnen weergeven van een voldoende groot cytoplasma een eenduidige detectie van de InlC signaal mogelijk. In de test geven we in dit artikel stellen we het gebruik van CCL2 HeLa-cellen, die bijzonder geschikt voor onze assay door de uitbreiding van de cytosolische ruimte zijn, andere HeLa klonen zoals HeLa-cellen Kyoto een kleiner cytoplasma maar kan worden gebruikt met onze infectieprotocol (HeLa…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Onderzoek in P. Cossart laboratorium wordt ondersteund door het Instituut Pasteur, het Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale, het Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233.348), de Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE- SignRupVac), de Louis-Jeantet Foundation en de Fondation Le Roch Les Mousquetaires. AK is een ontvanger van een beurs van het Pasteur-Paris University International Doctoral Program / Institut Carnot Maladies infectieuses. Wij danken Jason Mercer voor het optimaliseren van de cellulaire transfectieprotocol.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Bacto Brain Heart Infusion BD 237500 For liquid BHI preparation
Bacto Agar BD 214010 Supplement to liquid BHI for BHI agar plates
Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum Biowest 51830-500
DMEM Invitrogen 61965-026
Lipofectamine RNAiMax Invitrogen 13778-100
Gentamicin Sigma G1397-10ML
Formaldehyde (16%) EMS 15710 Prepare fresh before each experiment
Anti-Rabbit Alexa Fluor 546 Invitrogen A-11035
DAPI Invitrogen D-1306
Phalloidin Dy647 Dyomics 647-33
siRNA Scramble Dharmacon D-001810-10
siRNA Met Dharmacon L-003156-00-0005
Black 384-well microscopy cell culture plate Corning 3985
AxioObserver Z1 microscope Zeiss 431007 9901
sCMOS camera Andor Neo
Metamorph analysis software Molecular Devices 4000
CellProfiler analysis software Broad Institute Public software available at http://www.cellprofiler.org/

References

  1. Pizarro-Cerdá, J., Kühbacher, A., Cossart, P. Entry of Listeria monocytogenes in mammalian epithelial cells: an updated view. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2, 1-17 (2012).
  2. Mackaness, G. B. Cellular resistance to infection. Journal of Experimental Medicine. 116, 381-406 (1962).
  3. Tilney, L. G., Portnoy, D. A. Actin filaments and the growth, movement, and spread of the intracellular bacterial parasite, Listeria monocytogenes. Journal of Cell Biology. 109, 1597-1608 (1989).
  4. Mengaud, J., Chenevert, J., Geoffroy, C., Gaillard, J. L., Cossart, P. Identification of the structural gene encoding the SH-activated hemolysin of Listeria monocytogenes: listeriolysin O is homologous to streptolysin O and pneumolysin. Infection and Immunity. 55, 3225-3227 (1987).
  5. Gaillard, J. L., Berche, P., Frehel, C., Gouin, E., Cossart, P. Entry of L. monocytogenes into cells is mediated by internalin, a repeat protein reminiscent of surface antigens from gram-positive cocci. Cell. 65, 1127-1141 (1991).
  6. Mengaud, J., Dramsi, S., Gouin, E., Vazquez-Boland, J. A., Milon, G., Cossart, P. Pleiotropic control of Listeria monocytogenes virulence factors by a gene that is autoregulated. Molecular Microbiology. 5, 2273-2283 (1991).
  7. Kocks, C., Gouin, E., Tabouret, M., Berche, P., Ohayon, H., Cossart, P. L. monocytogenes-induced actin assembly requires the actA gene product, a surface protein. Cell. 68, 521-52 (1992).
  8. Glaser, P., et al. Comparative genomics of Listeria species. Science. 294, 849-852 (2001).
  9. Toledo-Arana, A., et al. The Listeria transcriptional landscape: from saprophytism to virulence. Nature. 459, 950-956 (2009).
  10. Cossart, P. Illuminating the landscape of host-pathogen interactions with the bacterium Listeria monocytogenes. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19484-19491 (1073).
  11. Mengaud, J., Ohayon, H., Gounon, P., Mege, R. -. M., Cossart, P. E-cadherin is the receptor for internalin, a surface protein required for entry of L. monocytogenes into epithelial cells. Cell. 84, 923-932 (1996).
  12. Shen, Y., Naujokas, M., Park, M., Ireton, K. InIB-dependent internalization of Listeria is mediated by the Met receptor tyrosine kinase. Cell. 103, 501-510 (2000).
  13. Lecuit, M., Hurme, R., Pizarro-Cerda, J., Ohayon, H., Geiger, B., Cossart, P. A role for alpha-and beta-catenins in bacterial uptake. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97, 10008-10013 (2000).
  14. Ireton, K., et al. A role for phosphoinositide 3-kinase in bacterial invasion. Science. 274, 780-782 (1996).
  15. Ireton, K., Payrastre, B., Cossart, P. The Listeria monocytogenes protein InlB is an agonist of mammalian phosphoinositide 3-kinase. Journal of Biological Chemistry. 274, 17025-17032 (1999).
  16. Pizarro-Cerdá, J., Jonquières, R., Gouin, E., Vandekerckhove, J., Garin, J., Cossart, P. Distinct protein patterns associated with Listeria monocytogenes InlA- or InlB phagosomes. Cellular Microbiology. 4, 101-115 (2002).
  17. Pizarro-Cerdá, J., Payrastre, B., Wang, Y. -. J., Veiga, E., Yin, H. L., Cossart, P. Type II phosphatidylinositol 4-kinases promote Listeria monocytogenes entry into target cells. Cellular Microbiology. 9, 2381-2390 (2007).
  18. Hamon, M. A., et al. Histone modifications induced by a family of bacterial toxins. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 104, 17555-17559 (2007).
  19. Ribet, D., et al. Listeria monocytogenes impairs SUMOylation for efficient infection. Nature. 464, 1192-1195 (2010).
  20. Rämet, M., Manfruelli, P., Pearson, A., Mathey-Prevot, B., Ezekowitz, R. A. Functional genomic analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli. Nature. 416, 644-648 (2002).
  21. Agaisse, H., Burrack, L. S., Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N., Higgins, D. E. Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection. Science. 309, 1248-1251 (2005).
  22. Cheng, L. W., Viala, J. P., Stuurman, N., Wiedemann, U., Vale, R. D., Portnoy, D. A. Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102, 13646-13651 (2005).
  23. Ripio, M. T., Domínguez-Bernal, G., Lara, M., Suárez, M., Vazquez-Boland, J. A. A Gly145Ser substitution in the transcriptional activator PrfA causes constitutive overexpression of virulence factors in Listeria monocytogenes. Journal of Bacteriology. 179, 1533-1540 (1997).
  24. Rajabian, T., et al. The bacterial virulence factor InlC perturbs apical cell junctions and promotes cell-to-cell spread of Listeria. Nature Cell Biology. 11, 1212-1218 (2009).
  25. Gouin, E., et al. The Listeria monocytogenes InlC protein interferes with innate immune responses by targeting the IκB kinase subinit IKKα. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107, 17333-17338 (2010).
  26. Pizarro-Cerdá, J., Lecuit, M., Cossart, P. Measuring and analysing invasion of mammalian cells by bacterial pathogens: the Listeria monocytogenes system. Methods in Molecular Microbiology. 31, 161-177 (2002).
  27. Snijder, B., Sacher, R., Rämö, P., Damm, E. M., Liberali, P., Pelkmans, L. Population context determines cell-to-cell variability in endocytosis and virus infection. Nature. 461, 520-523 (2009).

Play Video

Cite This Article
Kühbacher, A., Gouin, E., Mercer, J., Emmenlauer, M., Dehio, C., Cossart, P., Pizarro-Cerdá, J. Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes. J. Vis. Exp. (79), e51043, doi:10.3791/51043 (2013).

View Video