Neuronale Stammzellen aus dem erwachsenen Gehirn geerntet steigen in Anwendungen, die von der Grundlagenforschung der Entwicklung des Nervensystems zu erforschen mögliche klinische Anwendungen in der regenerativen Medizin eingesetzt. Dies macht eine strenge Kontrolle bei der Isolierung und Kultivierungsbedingungen verwendet werden, um diese Zellen entscheidend für experimentelle Ergebnisse klingen wachsen.
Neuere Arbeiten zeigen, dass das zentrale Nervensystem (ZNS) Regeneration und Tumorgenese beinhaltet Populationen von Stammzellen (SC) mit Wohnsitz im erwachsenen Gehirn. Aber die Mechanismen, diese normalerweise ruhenden Zellen beschäftigen, um die ordnungsgemäße Funktionsweise von neuronalen Netzwerken, sowie ihre Rolle in der Erholung von Verletzungen und Eindämmung von neurodegenerativen Prozessen sicherzustellen wenig verstanden. Diese Zellen befinden sich in Regionen als "Nischen", die eine tragende Umwelt mit modulierenden Signale sowohl von der Gefäß-und Immunsystem bieten bezeichnet. Die Isolierung, die Wartung und die Differenzierung von ZNS VZ unter definierten Kulturbedingungen, die unbekannte Faktoren auszuschließen, zugänglich macht Behandlung durch pharmakologische oder genetische Mittel, um Einblicke in ihre in vivo-Verhalten. Hier bieten wir detaillierte Informationen über die Methoden zur Erzeugung von Kulturen von ZNS-VZ aus verschiedenen Regionen des erwachsenen Gehirns und Ansätze zu ihrer d beurteilenifferentiation Potential in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten in vitro. Diese Technik ergibt eine homogene Zellpopulation als eine Monokultur, die sichtbar auf einzelne SCs und ihre Nachkommen zu untersuchen. Darüber hinaus kann es in verschiedenen Tiermodellsystemen und klinischen Proben angewendet werden kann, wobei zuvor zur regenerativen Antworten in der geschädigten adulten Nervensystems vorherzusagen.
Das zentrale Dogma der Neurobiologie, den von den grundlegenden Beobachtungen des Gehirns Zytoarchitektur von Ramón Y. Cajal vor über einem Jahrhundert gemacht gelegt, entschieden, dass die Neurogenese unwahrscheinlich war, nach der Adoleszenz angesichts der Komplexität der neuronalen Netze im ZNS 1 gefunden. Trotz der Arbeit von Altman in den 1960er Jahren und später Kaplan, die zeigen, dass 3 H-Thymidin konnte in reifen Neuronen darauf hinweist, dass in der Tat Neuronen wurden in verschiedenen Bereichen des erwachsenen Gehirns erzeugt gefunden werden, das Dogma weiterhin halten 2, 3. Evidence weiterhin mit Forschungs Nottebohms die jahreszeitlichen Veränderungen in der Anzahl der Singvogel in Gehirnen 4 vorhanden Neuronen beschreiben, zu montieren. Es war nicht bis 1999, als Gould et al. Veröffentlichten Arbeiten über die Erzeugung von Neuronen im Hippocampus steigt mit der Leistung der assoziativen Lernaufgaben in Ratte, sowie die Beobachtungen von Kornack und Rakic DemonstrationTing fortgesetzt Neurogenese im erwachsenen Makaken, die das Konzept einer weniger starren, plastischer Gehirn wurde erkannt 5, 6.
Die Suche nach der zellulären Quelle für diese de novo generierten Neuronen führen zur Entdeckung einer diskreten Population von Stammzellen (VZ), die in Bereichen des Gehirns befinden sich die als Nischen 7. Die Subventrikularzone und Unter körnige Zone des Hippocampus gelten als die beiden wichtigsten neurogenen Regionen 8,9 sein. Zellen aus diesen Standorten isoliert zeigen die klassische Merkmal der embryonalen oder fötalen abgeleitet VZ, Selbsterneuerung und Differenzierungspotenzial. Im Fall von neuralen Stammzellen (NSC), können sie in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten differenzieren. Darüber hinaus sind diese VZ Fleck positive fötale NSC Marker wie der Zwischen Filamentprotein Nestin 10. Neuere Arbeiten betont, dass SCs vielleicht nicht zu diesen t begrenzt werdenWO Bereiche auf und sind in der Tat im gesamten Gehirn lokalisiert als weitgehend ruhenden Zellpopulation fest mit dem Gefäßsystem 11 verbunden.
Die Beobachtungen, die VZ in Reaktion auf eine Verletzung mobilisiert legt die Möglichkeit, in der Lage, diese Zellen für regenerative Zwecke zu nutzen, um bei der Rückgewinnung von neurodegenerativen Erkrankung und Schlaganfall 12, 13 zu unterstützen. Das ist nicht anders als die Rolle, die mesenchymalen Stammzellen (MSCs) bei der Heilung von Bindegewebe spielen, die als perivaskuläre Zellen, die das Potenzial haben, Osteoblasten, Chondrozyten, und Fettzellen werden 14 zu finden sind. Jedoch NSC nicht in der gleichen Weise wie MSCs aus dem Knochenmark durch Routine Aspiration und Dichtegradientenzentrifugation Techniken geerntet und anschließend in autologe Zelltherapien verwendet. Als Folge müssen auch andere Zellen, wie etwa die Verwendung von fetalen NSC oder neuronalen Vorläuferzellen abgeleitet von embryonic Stammzellen wurden ausführlich in der Tier Krankheiten und Verletzungen Modelle mit unterschiedlichem Erfolg 15 erforscht. Induzierte pluripotente Stammzellen-Technologien nutzen somatischen Zellquellen bieten eine weitere Möglichkeit dazu bietet der zur Herstellung therapeutisch nützlichen Zell-basierte Therapien für eine Vielzahl von Anwendungen, die Überwindung der begrenzten Verfügbarkeit und ethische Bedenken hinsichtlich der Verwendung von embryonalen Zellen und fetalen Gewebe 16. Allerdings klinische Umsetzung dieser Erkenntnisse hat sich als eine schwierige Aufgabe sein, wie in den Kämpfen der Behandlung verschiedener neurologischer Erkrankungen mit SC-basierten therapeutischen Ansätze gezeigt, 17,18 sowie einen gewundenen Pfad zu Regulierungsfreiheit. Als Alternative kann die Einführung von spezifischen pharmakologischen Behandlungen NSC Zahlen modulieren und zu erleichtern Erholung in Modellen der Parkinson-Krankheit und Schlaganfall 19. Was auch immer die Strategie könnte sein, zu verstehen, wie diese Zellen effektiv zu manipulierenerfordert eine in vitro-System zugänglich.
Kulturen von NSC kann entweder als Aggregatkulturen, auch bekannt als Neurosphären, oder als Monoschicht 8,20 durchgeführt werden. Beide Verfahren sind weit verbreitet, die die Einführung von definierten Kulturbedingungen, zB die Verwendung des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF) oder basischen Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) als Mitogen Quelle, die für die Expansion von multi Vorstufen bereitzustellen. Während Neurosphärenkulturen zur Untersuchung klonale Vermehrung Fähigkeit eines isolierten Zelltyp besser geeignet ist das System gezeigt, um eine gemischte Population von Zellen während der Expansion 21 zu erzeugen. Darüber hinaus ist die geschlossene Struktur von Neurosphären die pharmakologische Manipulation der Zellen unpraktisch, und die Interpretation der Einfluss diese Faktoren haben könnten, aufgrund der in der Neurosphäre etabliert Mikroumgebung verwechselt werden. Monolayer-Kulturen, andererseits kann seinin der Hochdurchsatz-Screening von Bibliotheken kleiner Moleküle verwendet, wodurch ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Signalübertragungsmechanismen, die SC Wachstum und Differenzierung regulieren und eröffnet die Möglichkeit, neue Verbindungen, die speziell auf diese Zellpopulation entdecken, zu erkunden.
Als Folge kann die Fähigkeit, reproduzierbar Kulturen adulter NSC aus unterschiedlichen Bereichen von Interesse im Gehirn generiert in einem breiten Spektrum von Forschungsanwendungen verwendet werden, die von Entwicklungsstudien des zentralen Nervensystems (ZNS) zu erforschen neuartige regenerative Medizin Ansätze . Die hier vorgestellte Protokoll zeigt, wie zu sezieren und bewerten die Differenzierungspotenzial von ZNS-VZ von der erwachsenen Gehirn von Nagetieren isoliert.
Viele der Schritte für eine erfolgreiche Isolierung, Expansion und Differenzierung von neuronalen Stammzellen aus adulten Gehirn sind gemeinsam mit Standardgewebekulturtechniken geteilt. Das Ziel zu bedenken ist, dass NSCs aus dem erwachsenen Gehirn isoliert als viele ihrer in-vivo-Eigenschaften wie möglich (2J) zu halten. Oft ist eine Balance zwischen notwendigen Vorsicht und angemessener Geschwindigkeit muss gefunden werden. Pflege mit der Isolierung des Gehirn aus dem Schädel machen die I…
The authors have nothing to disclose.
Imaging and Curing Umweltstoffwechselkrankheiten, durch die Initiative und Netzwerkfonds der Helmholtz-Gemeinschaft, einen Zuschuss von der Else Kröner-Fresenius-Stiftung, und ein Stipendium der Deutschen Forschungsgemeinschaft (- Diese Arbeit wurde von der Helmholtz-Allianz ICEMED finanziert (teilweise) SFB 655: Zellen in Gewebe).
6-well tissue culture dishes | BD Biosciences | 353934 | ||
Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P-3655 |
5 mg/ml stock solution prepared in double distilled water (Stable for several months at -20 °C). Working concentration 0.5 mg/ml in water (Stable for 1 month at 4 °C). |
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Fibronectin | R&D Systems | 1030-Fn | Do not agitate stock solution | |
Filtration Apparatus | Corning Life Sciences | 430769 | ||
DMEM/F-12 | Mediatech | 10-090-CV | See note below for complete N2 media preparation | |
Apo-transferrin | Sigma-Aldrich | T-2036 | ||
Insulin | Sigma-Aldrich | I-0516 | ||
Putrescine | Sigma-Aldrich | P-5780 | 1 M stock solution in ddH2O (Stable at 20 °C for 6 months) | |
Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S-5261 | 500 µM stock solution in ddH2O (Stable at -20 °C for 6 months) | |
Progesterone | Sigma-Aldrich | P-8783 | 100 µM stock solution in ethanol (Stable at -20°C for 6 months) | |
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | ||
Phosphate Buffered Saline | Mediatech | 21-040-CV | ||
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | R&D Systems | 233-FB | Working concentration 20 ng/ml | |
Delta4 (Dll4) | R&D Systems | 1389-D4 | Working concentration 500 ng/ml | |
Angiopoetin 2 (Ang2) | R&D Systems | 623-AN | Working concentration 500 ng/ml | |
JAK Inhibitor | Calbiochem | 420099 | Working concentration 200 nM | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A-2058 | ||
15- and 50-ml Conical tubes | Corning Life Sciences | 430053, 430829 | ||
Other necessary items include: General dissection instruments, including razor blade and forceps, Adult rat (3-6 months old; Sprague-Dawley or Long Evans), CO2 intoxication chamber, Laminar flow hood for cell culture and incubator Incubator (humidified, 37 °C, 5% CO2, 5% O2). Note: For complete N2 media preparation, to one bottle of DMEM/F-12 (500 ml) add 0.05 g of apotransferin, 0.0125 g of insulin (freshly predissolved in 1 ml of 10 mM NaOH), 50 μl of putrescine, 30 μl of sodium selenite, 100 μl of progesterone stocks, and 5 ml of penicillin/streptomycin solution. Adjust pH to 7.2, if needed. Filter-sterilize and store at 4 °C for up to 3 weeks and protect from light. | ||||
[header] | ||||
Immunofluorescence Reagents Table | ||||
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15719 | ||
Normal Donkey Serum (NDS) | Sigma-Aldrich | D-9663 | ||
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-8787 | ||
4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D-8417 | 5 mg/ml stock solution in methanol | |
[header] | ||||
Primary Antibody Table | ||||
Nestin | Chemicon | MAB353 |
Dilution Factor: 1:400 Species: Mouse IgG1 |
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Hes3 | Santa Cruz | sc-25393 |
Dilution Factor: 1:100 Species: Rabbit IgG |
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Sox2 | R&D Systems | MAB2018 |
Dilution Factor: 1:100 Species: Mouse IgG2a |
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CNPase | Chemicon | MAB326 |
Dilution Factor: 1:200 Species: Mouse IgG1 |
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β-tubulin III (TUJ1) | R&D Systems | MAB1195 |
Dilution Factor: 1:500 Species: Mouse IgG2a |
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Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) | Dako North America | Z0334 |
Dilution Factor 1:500 Species: Rabbit |
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[header] | ||||
Secondary Antibody Table | ||||
Alexa 568 | Invitrogen | A-21124 |
Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG1 |
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Alexa 488 | Invitrogen | A-21131 |
Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG2a |
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Cy5 | Jackson ImmunoResearch | 59883 |
Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Rabbit |