Neurale stamcellen geoogst uit de volwassen hersenen worden steeds gebruikt in toepassingen, variërend van het fundamenteel onderzoek van de ontwikkeling van het zenuwstelsel aan het verkennen van potentiële klinische toepassingen in de regeneratieve geneeskunde. Dit maakt strenge controle op de isolatie en kweekomstandigheden gebruikt om deze cellen cruciaal voor experimentele resultaten goed groeien.
Recent onderzoek toont aan dat het centrale zenuwstelsel (CNS) regeneratie en het ontstaan van tumoren gaat populaties van stamcellen (SC) ingezetene in de volwassen hersenen. Echter, de mechanismen die normaal rustende cellen gebruiken om de goede werking van neurale netwerken, alsook hun rol in het herstel van de schade en de beperking van neurodegeneratieve processen te waarborgen zijn weinig begrepen. Deze cellen verblijven aangeduid als "niches" dat een onderhoudende milieu door modulerende signalen van zowel de vasculaire en immuun systemen regio. De isolatie, onderhoud, en differentiatie van CNS SCs onder gedefinieerde kweekomstandigheden die onbekende factoren uit te sluiten, maakt ze toegankelijk zijn voor behandeling met farmacologische of genetische middelen, en geven zicht op hun in vivo gedrag. Hier bieden we gedetailleerde informatie over de methoden voor het genereren van culturen van CNS SC's uit verschillende regio's van de volwassen hersenen en benaderingen om hun d beoordelenifferentiation potentieel tot neuronen, astrocyten en oligodendrocyten in vitro. Deze techniek levert een homogene celpopulatie een monolaag cultuur die kunnen worden gevisualiseerd individuele SC en hun nageslacht bestuderen. Bovendien kan het worden toegepast in verschillende diermodellen en klinische monsters, die eerder werden gebruikt voor regeneratieve reacties in de beschadigde volwassen zenuwstelsel voorspellen.
Het centrale dogma van neurobiologie, door de fundamentele opmerkingen van de hersenen cytoarchitecture gemaakt door Ramón Y. Cajal meer dan een eeuw geleden gelegd, geoordeeld dat neurogenese onwaarschijnlijk was na de adolescentie gezien de complexiteit van de neurale netwerken in het CZS 1. Hoewel de werkzaamheden van Altman in de jaren 1960 en later Kaplan, waaruit blijkt dat 3H-thymidine kunnen worden gevonden in volwassen neuronen aangeeft dat daadwerkelijk neuronen werden geproduceerd in verschillende gebieden van de volwassen hersenen, het dogma bleef houden 2, 3. Bewijs bleef te monteren met Nottebohm onderzoek beschrijft de seizoensgebonden veranderingen in het aantal neuronen aanwezig in zangvogel hersenen 4. Het was niet tot 1999, toen Gould et al.. Gepubliceerde werk op de generatie van neuronen in de hippocampus neemt toe met de prestaties van associatieve leertaken in rat, evenals de opmerkingen van Kornack en Rakic demonstratieting verder neurogenese in de volwassen makaak dat het begrip minder stijve, meer kunststof hersenen, werd erkend 5, 6.
De zoektocht naar de cellulaire bron voor deze novo gegenereerde neuronen leiden tot de ontdekking van een discrete populatie van stamcellen (SC) dat in gebieden van de hersenen verblijven genoemd niches 7. Subventriculaire zone sub korrelige gebied van de hippocampus worden beschouwd als de twee belangrijkste neurogene regio 8,9 zijn. Cellen geïsoleerd uit deze locaties toont de klassieke kenmerken van embryonale of foetale afgeleide SC, zelfvernieuwing en differentiatie potentieel. Bij neurale stamcellen (NSC's), kunnen ze worden gedifferentieerd tot neuronen, astrocyten en oligodendrocyten. Bovendien, deze SC vlek positief voor foetale NSC merkers zoals het intermediaire filament eiwit nestine 10. Meer recent werk benadrukt dat SC's niet kan worden beperkt tot deze two gebieden, en in feite gelokaliseerd door de hersenen als een grotendeels rustende populatie cellen stevig verbonden aan het vaatstelsel 11.
De opmerkingen die SCS gemobiliseerd in reactie op letsel suggereert de mogelijkheid van het kunnen deze cellen te gebruiken voor regeneratieve doeleinden om te helpen bij het herstel van neurodegeneratieve ziekte en beroerte 12, 13. Dit is niet anders dan de rol die mesenchymale stamcellen (MSC's) spelen bij de genezing van bindweefsel, die worden aangetroffen als perivasculaire cellen die het potentieel om osteoblasten, chondrocyten en vetcellen 14 geworden. Echter, NSCs niet op dezelfde wijze als MSCs geoogst uit beenmerg door routine aspiratie en dichtheidsgradiënt centrifugatie technieken en vervolgens gebruikt in autologe cellen gebaseerde therapieën. Bijgevolg andere bronnen van cellen, zoals het gebruik van foetale NSCs of neuronale precursors afgeleid van embryonic stamcellen zijn uitgebreid onderzocht in dierlijke ziekten en letsel modellen met wisselend succes 15. Geïnduceerde pluripotente stamcel technologieën gebruik te maken van somatische cellen bronnen bieden een andere potentiële weg voor de productie van therapeutisch bruikbare cel-gebaseerde therapieën voor een breed scala van toepassingen, het overwinnen van de beperkte beschikbaarheid en ethische bezorgdheid over het gebruik van embryonale cellen en foetale weefsels 16. Klinische vertaling van deze bevindingen blijkt een moeilijke taak, zoals gedemonstreerd in de strijd van de behandeling van verschillende neurologische aandoeningen met SC-gebaseerde therapeutische benaderingen 17,18, evenals een kronkelige baan regelgevende goedkeuring. Als alternatieve benadering kan invoering van specifieke farmacologische behandelingen NSC nummers moduleren en herstel van de ziekte van Parkinson en beroerte 19 vergemakkelijken. Ongeacht de strategie kan worden, begrijpen hoe ze effectief te manipuleren deze cellenvereist een toegankelijk in vitro systeem.
Culturen van NSCs kan worden uitgevoerd als aggregaat culturen, ook bekend als neurosferen, of een monolaag 8,20. Beide technieken zijn op grote schaal gebruikt, waardoor de vestiging van bepaalde kweekomstandigheden, dwz gebruik van epidermale groeifactor (EGF) of basische fibroblast groeifactor (bFGF) als een mitogeen bron, die voorzien in de uitbreiding van multipotente voorlopers. Terwijl neurosfeerculturen beter geschikt voor het bestuderen van klonale vermeerdering vermogen van een geïsoleerde celtype zijn, is het systeem getoond om een gemengde populatie van cellen tijdens de expansie 21. Bovendien, de gesloten structuur neurosferen maakt farmacologische manipulatie van de cellen onpraktisch en de interpretatie van deze factoren invloed kunnen hebben kunnen verward worden door de in de neurosphere zich gevestigd micromilieu. Monolaagkweken, anderzijds, kanwerkzaam in high throughput-schermen van kleine molecule bibliotheken, die een krachtig hulpmiddel om de signaaltransductie mechanismen die SC groei en differentiatie regelen en opent de mogelijkheid om nieuwe verbindingen die specifiek deze cel bevolking ontdekken verkennen.
Bijgevolg kan de mogelijkheid om reproduceerbaar genereren kweken van volwassen NSCs uit verschillende gebieden van belang in de hersenen worden gebruikt in een breed spectrum van wetenschappelijke toepassingen, variërend van ontwikkelingsstudies van het centrale zenuwstelsel (CZS) te onderzoeken van nieuwe regeneratieve geneeskunde benaderingen . De hier gepresenteerde protocol laat zien hoe te ontleden en de differentiatie potentieel van CNS SC's geïsoleerd van de volwassen knaagdierhersenen beoordelen.
Veel van de kritische stappen succesvolle isolatie, expansie en differentiatie van neurale stamcellen uit volwassen hersenen worden gedeeld gemeen met standaard weefselkweektechnieken. De doelstelling om in gedachten te houden is dat NSCs geïsoleerd van de volwassen hersenen als veel van hun in vivo eigenschappen mogelijk (Figuur 2J) moet blijven. Vaak een evenwicht tussen noodzakelijke voorzichtigheid en gepaste snelheid moet worden gevonden. Zorg met de isolatie van de hersenen uit de schede…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gefinancierd (gedeeltelijk) door de Helmholtz Alliance ICEMED – Imaging en Genezen Milieu Metabole Ziekten, via het Initiatief en Netwerk Fonds van de Helmholtz Association, een subsidie van de Else Kroener-Fresenius Foundation, en een subsidie van de Deutsche Forschungsgemeinschaft ( SFB 655: cellen in de weefsels).
6-well tissue culture dishes | BD Biosciences | 353934 | ||
Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P-3655 |
5 mg/ml stock solution prepared in double distilled water (Stable for several months at -20 °C). Working concentration 0.5 mg/ml in water (Stable for 1 month at 4 °C). |
|
Fibronectin | R&D Systems | 1030-Fn | Do not agitate stock solution | |
Filtration Apparatus | Corning Life Sciences | 430769 | ||
DMEM/F-12 | Mediatech | 10-090-CV | See note below for complete N2 media preparation | |
Apo-transferrin | Sigma-Aldrich | T-2036 | ||
Insulin | Sigma-Aldrich | I-0516 | ||
Putrescine | Sigma-Aldrich | P-5780 | 1 M stock solution in ddH2O (Stable at 20 °C for 6 months) | |
Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S-5261 | 500 µM stock solution in ddH2O (Stable at -20 °C for 6 months) | |
Progesterone | Sigma-Aldrich | P-8783 | 100 µM stock solution in ethanol (Stable at -20°C for 6 months) | |
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | ||
Phosphate Buffered Saline | Mediatech | 21-040-CV | ||
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | R&D Systems | 233-FB | Working concentration 20 ng/ml | |
Delta4 (Dll4) | R&D Systems | 1389-D4 | Working concentration 500 ng/ml | |
Angiopoetin 2 (Ang2) | R&D Systems | 623-AN | Working concentration 500 ng/ml | |
JAK Inhibitor | Calbiochem | 420099 | Working concentration 200 nM | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A-2058 | ||
15- and 50-ml Conical tubes | Corning Life Sciences | 430053, 430829 | ||
Other necessary items include: General dissection instruments, including razor blade and forceps, Adult rat (3-6 months old; Sprague-Dawley or Long Evans), CO2 intoxication chamber, Laminar flow hood for cell culture and incubator Incubator (humidified, 37 °C, 5% CO2, 5% O2). Note: For complete N2 media preparation, to one bottle of DMEM/F-12 (500 ml) add 0.05 g of apotransferin, 0.0125 g of insulin (freshly predissolved in 1 ml of 10 mM NaOH), 50 μl of putrescine, 30 μl of sodium selenite, 100 μl of progesterone stocks, and 5 ml of penicillin/streptomycin solution. Adjust pH to 7.2, if needed. Filter-sterilize and store at 4 °C for up to 3 weeks and protect from light. | ||||
[header] | ||||
Immunofluorescence Reagents Table | ||||
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15719 | ||
Normal Donkey Serum (NDS) | Sigma-Aldrich | D-9663 | ||
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-8787 | ||
4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D-8417 | 5 mg/ml stock solution in methanol | |
[header] | ||||
Primary Antibody Table | ||||
Nestin | Chemicon | MAB353 |
Dilution Factor: 1:400 Species: Mouse IgG1 |
|
Hes3 | Santa Cruz | sc-25393 |
Dilution Factor: 1:100 Species: Rabbit IgG |
|
Sox2 | R&D Systems | MAB2018 |
Dilution Factor: 1:100 Species: Mouse IgG2a |
|
CNPase | Chemicon | MAB326 |
Dilution Factor: 1:200 Species: Mouse IgG1 |
|
β-tubulin III (TUJ1) | R&D Systems | MAB1195 |
Dilution Factor: 1:500 Species: Mouse IgG2a |
|
Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) | Dako North America | Z0334 |
Dilution Factor 1:500 Species: Rabbit |
|
[header] | ||||
Secondary Antibody Table | ||||
Alexa 568 | Invitrogen | A-21124 |
Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG1 |
|
Alexa 488 | Invitrogen | A-21131 |
Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG2a |
|
Cy5 | Jackson ImmunoResearch | 59883 |
Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Rabbit |