Summary

Fast Micro-iontoforesis de glutamato y GABA: una herramienta útil para investigar la integración sináptica

Published: July 31, 2013
doi:

Summary

En este artículo presentamos micro-iontoforesis rápida de los neurotransmisores como técnica para investigar la integración de las señales postsináptica con alta precisión espacial y temporal.

Abstract

Uno de los intereses fundamentales de la neurociencia es entender la integración de entradas excitadoras e inhibidoras a lo largo de la muy compleja estructura del árbol dendrítico, que finalmente conduce a la producción neuronal de potenciales de acción en el axón. La influencia de diversos parámetros espaciales y temporales de entrada sináptica específica en la salida neuronal está actualmente bajo investigación, por ejemplo, la atenuación dependiente de la distancia de las entradas dendríticas, la interacción dependiente de la ubicación de las entradas espacialmente segregadas, la influencia de la inhibición GABAergig en la integración excitatorio, lineal y modos de integración no lineales, y muchos más.

Con micro-iontoforesis rápido de glutamato y GABA es posible investigar con precisión la integración espacial y temporal de la excitación glutamatérgica y la inhibición GABAérgica. Requisitos técnicos críticos son o bien una lámpara fluorescente activado, el diodo emisor de luz (LED), o una de dos fotones scanning microscopio para visualizar ramas dendríticas sin introducir significativa foto-daño del tejido. Además, es muy importante tener un amplificador de micro-iontoforesis que permite la compensación de capacitancia rápido de pipetas de alta resistencia. Otro punto crucial es que ningún transmisor se libera involuntariamente por la pipeta durante el experimento.

Una vez establecida, esta técnica dará señales fiables y reproducibles con una alta especificidad y neurotransmisor ubicación. En comparación con el glutamato y GABA uncaging, iontoforesis rápido permite el uso de dos transmisores en el mismo tiempo pero en lugares muy distantes sin limitación para el campo de visión. También hay ventajas en comparación con la estimulación eléctrica focal de axones: con micro-iontoforesis se conoce definitivamente la ubicación del sitio de entrada y es seguro de que sólo se libera el neurotransmisor de interés. Sin embargo, tiene que tener en cuenta que sólo con micro-iontoforesis lapostsynapse se activa y aspectos presináptica de la liberación de neurotransmisores que no se resuelven. En este artículo se demuestra cómo crear micro-iontoforesis en experimentos de cortes de cerebro.

Introduction

Las neuronas en el sistema nervioso central reciben una variedad de entradas sinápticas en sus procesos dendríticos delgadas y ramificadas 1. Allí, la mayoría de las entradas excitadoras dendríticas están mediadas por las sinapsis glutamatérgicas. Estas sinapsis se pueden activar de una manera distribuida en el espacio, lo que resulta en la integración lineal postsináptica de los potenciales postsinápticos excitatorios (EPSP). Si las sinapsis se activan de forma simultánea y en proximidad espacial en la dendrita, estas entradas excitadoras pueden ser integrados supra-linealmente y generan picos dendríticas 2-5.

Además, la integración de entradas excitadoras depende de la ubicación de la entrada en el árbol dendrítico. Las señales que llegan a la región distal del mechón son mucho más atenuado que las entradas proximal por filtrado de cable 6. En el hipocampo, las entradas distantes a las dendritas apicales penacho se generan por una región del cerebro diferente que los de proximal dendriTES 7. Una cuestión interesante es por lo tanto, la forma de entrada sináptica es procesada por diferentes compartimentos dendríticas y si la integración dendríticas regula la influencia de estas entradas en capas sobre el disparo neuronal de diferentes maneras.

No sólo las propiedades funcionales, las características morfológicas de la dendrita, la ubicación y la agrupación de las entradas están afectando a la integración dendríticas de entradas excitadoras, también las entradas inhibidoras adicionales de terminales GABAérgicas crucial determinar la eficacia de las sinapsis glutamatérgicas 8,9. Estos diferentes aspectos de la integración sináptica pueden ser investigados utilizando idealmente neurotransmisor micro-iontoforesis, que permite la aplicación espacialmente definida de diferentes neurotransmisores a los dominios dendríticas. Estamos aquí demostrar la forma de establecer con éxito micro-iontoforesis de glutamato y GABA para investigar la integración de señales en las neuronas.

Para esta aplicación, de punta finase utilizan pipetas de alta resistencia llenos de soluciones concentradas de neurotransmisores. Estas pipetas están posicionados cerca de la membrana externa de la célula, donde se encuentran los receptores de los neurotransmisores. Es necesaria una buena visualización de las ramas dendríticas. Esto se logra mejor mediante tintes fluorescentes, que se introducen a través de la pipeta parche. A continuación, un impulso de corriente muy corto (<1 ms) (en el rango de 10 a 100 nA) se utiliza para expulsar las moléculas neurotransmisoras cargadas. Con estos pulsos cortos y compensación de capacitancia efectiva, potenciales o corrientes postsinápticas pueden ser evocados con alta precisión temporal y espacial, lo que significa que se conoce con precisión la ubicación de la entrada excitadora. El glutamato micro-iontoforesis puede activar sinapsis en un radio definido, que es menor que 6 m como se muestra aquí (Figura 1 9), pero también es posible llegar a resolución sinapsis única 10-12.

Heine, M., y col </em> mostró que la resolución espacial de las micro-iontoforesis rápido, incluso se puede ajustar para detectar tamaños por debajo de 0,5 micras, que es más pequeño que tamaños de los puntos alcanzados regularmente con uncaging de dos fotones de glutamato 13. Con micro-iontoforesis rápido que es fácilmente posible usar dos o más pipetas iontoforéticos y colocarlos en diferentes lugares, aunque distantes en el árbol dendrítico. De esta manera, la integración de eventos excitatorios, incluidos los de las diferentes vías, se puede investigar. También es posible utilizar un glutamato y una pipeta iontoforético lleno de GABA en el mismo tiempo. De esta manera el efecto de la inhibición GABAérgica en diferentes ubicaciones relativas a la entrada de excitación (en-camino, la inhibición de fuera de ruta) puede ser estudiada. Además, el impacto de la inhibición por interneuronas dirigidos dominios neuronales específicas, como las dendritas distales, soma o axones 14, puede ser investigada utilizando iontoforesis GABA. En las neuronas cultivadas, micro-iontoforesis rápido ofrece la oportunidad de investigate distribución de sinapsis individuales y los aspectos elementales de la comunicación sináptica en las neuronas de muchos más detalles 10,11.

En este artículo se demuestra en detalle la forma de establecer la iontoforesis glutamato y GABA para el uso en rodajas de cerebro de agudos, lo que permite que investigan la integración sináptica de entradas excitadoras e inhibidoras en dependencia de la ubicación de entrada, los puntos fuertes de entrada, y el momento, solo o en interacción. Vamos a señalar las ventajas y limitaciones de esta técnica y cómo solucionar con éxito.

Protocol

1. Requisitos del sistema Sistema de microscopio: buena visualización de la dendrita es crucial. Si está disponible, utilice un sistema de microscopía de escaneo láser de dos fotones. En nuestros experimentos hemos utilizado un ámbito TRIM II, LaVision Biotec, Bielefeld, Alemania o un sistema Ultima IV, Tecnologías de la Prairie, Middleton, Wisconsin equipado con un Ti: Sapphire-pulsos láser ultrarrápidos (Camaleón Ultra II, coherente) y un objetivo de alto NA (60X, 0,9 NA, Olympus) para visualizar l…

Representative Results

Un enfoque simple para determinar la extensión espacial de la iontoforesis es para retraer la pipeta iontoforético paso a paso de la dendrita, mientras se mantiene constante la glutamato expulsado. Hemos encontrado que la extensión espacial de una estimulación de micro-iontoforético tenía un diámetro de aproximadamente 12 micras (Figura 1 que muestra radio). ¿Qué tan profundo en el tejido de la iontoforesis se puede utilizar depende de la rigidez de la pipeta. Sin embargo, las pipetas iontofor?…

Discussion

Aquí le explicamos cómo aplicar micro-iontoforesis rápida de los neurotransmisores para investigar la integración sináptica en las dendritas. Esta técnica se ha utilizado con éxito para investigar la transmisión sináptica glutamatérgica y GABAérgica en diferentes regiones del cerebro in vitro e in vivo 9,20-22. Micro-iontoforesis se ha utilizado durante más de 60 años, pero en los primeros años, se utiliza sobre todo para bien aplicar localmente neurotransmisores y fármacos en…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Damos las gracias a Hans Reiner pólder, Martin Fuhrmann y Walker Jackson para leer detenidamente el manuscrito. Los autores recibieron financiación que fue proporcionada por el Ministerio de Investigación MIWF del estado de Renania del Norte-Westfalia (SR), el BMBF-Projekträger DLR colaboración entre Estados Unidos y Alemania en neurociencia computacional (CRCNS, SR), Centros de Excelencia en Enfermedades Neurodegenerativas (COEN; SR), y la Universidad del programa de financiación habitual Bonn (BONFOR; SR).

Materials

      Material
Two-photon laser scanning microscope (TRIM Scope II), and Ultima IV, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin) LaVision Biotec, Bielefeld, Germany    
Two-photon laser scanning microscope Ultima IV Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin, USA    
Ti:Sapphire ultrafast-pulsed laser Chameleon Ultra II, Coherent    
60X Objective, NA 0.9 Olympus    
Zeiss Axioskop 2 FS upright microscope TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany    
Monochromator TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany    
Micro-iontophoresis system MVCS-02 NPI Electronics, Tamm, Germany    
Sutter puller P-97 Sutter Instrument Company, Novato, CA    
Glass filaments (150 GB F 8P) Science Products, Hofheim, Germany    
      Reagent
Alexa Fluor 488 hydrazide Molecular Probes life technologies A-10436  
Alexa Fluor 594 Molecular Probes life technologies A-10438  
NaCl Sigma Aldrich S7653  
KCl Sigma Aldrich P9333  
NaH2PO4 Sigma Aldrich S8282  
NaHCO3 Sigma Aldrich S6297  
Sucrose Sigma Aldrich S7903  
CaCl2 Sigma Aldrich C5080  
MgCl2 Sigma Aldrich M2670  
Glucose Sigma Aldrich G7528  
K-Gluconate Sigma Aldrich G4500  
HEPES-acid Sigma Aldrich H4034  
Phosphocreatin Sigma Aldrich P7936  
EGTA Sigma Aldrich E3889  
Glutamic acid Sigma Aldrich G8415  
GABA Sigma Aldrich A5835  
NaOH Merck 1.09137.1000  
HCl Merck 1.09108.1000  

References

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Cite This Article
Müller, C., Remy, S. Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration. J. Vis. Exp. (77), e50701, doi:10.3791/50701 (2013).

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