Summary

Schnelle Micro-Iontophorese von Glutamat und GABA: Ein nützliches Tool, um Synaptic Integration Untersuchen

Published: July 31, 2013
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Summary

In diesem Artikel stellen wir schnell Mikro-Iontophorese von Neurotransmittern als eine Technik, um die Integration von postsynaptischen Signale mit hoher räumlicher und zeitlicher Präzision zu untersuchen.

Abstract

Eines der grundlegenden Interessen in den Neurowissenschaften ist es, die Integration von erregenden und hemmenden Eingänge entlang der sehr komplexen Struktur der dendritischen Baumes, die schließlich führt zu neuronalen Ausgang der Aktionspotentiale am Axon verstehen. Der Einfluss verschiedener räumlicher und zeitlicher Parameter des spezifischen synaptischen Eingang neuronale Ausgang wird derzeit untersucht, z. B. den Abstand Dämpfung von dendritischen Eingänge, die ortsabhängige Wechselwirkung von räumlich getrennten Eingängen der Einfluss GABAergig Hemmung exzitatorischen Integration linearen und nichtlineare Integration Modi und vieles mehr.

Mit schnellen Mikro-Iontophorese von Glutamat und GABA ist es möglich, genau zu untersuchen, die räumliche und zeitliche Integration der glutamatergen Anregung und GABAergen Hemmung. Critical technischen Anforderungen entweder eine ausgelöste Leuchtstofflampe, Leuchtdiode (LED) oder eine Zwei-Photonen-scanning Mikroskop zu dendritischen Zweigen, ohne dabei signifikante Foto-Schädigung des Gewebes sichtbar zu machen. Weiterhin ist es sehr wichtig, eine Mikro-Verstärker Iontophorese, das eine schnelle Kompensation der Kapazität hohe Pipetten ermöglicht haben. Ein weiterer entscheidender Punkt ist, dass kein Sender unfreiwillig durch die Pipette während des Experiments veröffentlicht.

Einmal eingerichtet, wird diese Technik zuverlässige und reproduzierbare Signale mit einer hohen Spezifität Neurotransmitter und Lage geben. Im Vergleich zu Glutamat und GABA Uncaging, ermöglicht eine schnelle Iontophorese mit beiden Sendern gleichzeitig aber zu sehr weit entfernten Orten ohne Einschränkung des Sichtfeldes. Es gibt auch Vorteile gegenüber Schwerpunkt elektrische Stimulation von Axonen: mit Mikro-Iontophorese die Lage des Eingangs Website ist definitiv bekannt und es ist sicher, dass nur der Neurotransmitter von Interesse freigesetzt wird. Allerdings ist zu berücksichtigen, dass mit Mikro-Iontophorese werden nur diePostsynapse aktiviert und präsynaptischen Aspekte der Freisetzung von Neurotransmittern werden nicht aufgelöst. In diesem Artikel zeigen wir Ihnen, wie Sie Mikro-Iontophorese in Hirnschnitt Experimente.

Introduction

Neuronen im zentralen Nervensystem erhalten eine Vielzahl von synaptischen Eingänge auf ihren dünnen und verzweigten dendritischen Prozesse 1. Es sind die meisten der exzitatorischen dendritischen Eingänge glutamatergen Synapsen vermittelt. Diese Synapsen in einem räumlich verteilten Weise aktiviert werden, was zu postsynaptischen lineare Integration von exzitatorischen postsynaptischen Potentiale (EPSP). Wenn die Synapsen gleichzeitig und in räumlicher Nähe auf der Dendriten aktiviert sind, können diese exzitatorischen Eingänge supra-linear integriert werden und erzeugen dendritische Dornen 2-5.

Darüber hinaus hängt die Integration von exzitatorischen Eingänge von der Lage des Eingangs auf die dendritische Struktur. Signale, die am distalen Büschel Region ankommen sind viel stärker gedämpft als proximalen Eingänge aufgrund Kabel Filterung 6. Im Hippocampus, werden entfernte Eingänge zu den apikalen Dendriten Büschel durch eine andere Hirnregion als die auf proximalen dendri erzeugttes 7. Eine spannende Frage ist daher, wie synaptische Input von verschiedenen dendritischen Fächer verarbeitet und wenn dendritischen Integration regelt den Einfluss dieser geschichteten Eingänge auf neuronale Aktivität in unterschiedlicher Weise.

Nicht nur die funktionellen Eigenschaften, morphologische Merkmale des Dendriten, sind der Ort und die Clusterbildung der Eingänge, die die dendritische Integration von exzitatorischen Eingänge, die auch die zusätzliche hemmende Eingänge von GABAergen Terminals bestimmen maßgeblich die Wirksamkeit der glutamatergen Synapsen 8,9. Diese verschiedenen Aspekte der synaptischen Integration lässt sich ideal mit untersucht werden Neurotransmitter Mikro-Iontophorese, die räumlich definierte Anwendung verschiedener Neurotransmitter ermöglicht dendritischen Domänen. Wir zeigen hier, wie man erfolgreich etablieren Mikro-Iontophorese von Glutamat und GABA um das Signal Integration in Neuronen zu untersuchen.

Für diese Anwendung, spitzenhohe Beständigkeit Pipetten mit konzentrierter Neurotransmitter Lösungen gefüllt werden. Diese Pipetten sind in der Nähe der äußeren Membran der Zelle, wobei die Neurotransmitter-Rezeptoren befinden positioniert. Eine gute Visualisierung der dendritischen Äste erforderlich. Dies wird am besten durch Fluoreszenzfarbstoffe, die über der Patch-Pipette eingeführt werden. Dann wird eine sehr kurze (<1 ms) Stromimpuls (im Bereich 10 – 100 nA) verwendet wird, um die geladenen Neurotransmittermolekülen auszuwerfen. Mit diesen kurzen Pulsen und effektive Kapazität Kompensation kann postsynaptischen Potentiale oder Ströme mit hoher zeitlicher und räumlicher Präzision, die die Lage des exzitatorischen Eingang genau bekannt ist bedeutet hervorgerufen werden. Glutamate Mikro-Iontophorese kann Synapsen in einem definierten Radius, der kleiner als 6 um, wie hier (1 9) gezeigt wird, zu aktivieren, sondern es ist auch möglich, einzelne Synapse Auflösung 10-12 zu erreichen.

Heine, M., et al </em> zeigte, dass die räumliche Auflösung des schnellen Mikro-Iontophorese auch eingestellt werden, um Größen unterhalb 0,5 um, die kleiner als Messfelder regelmäßig mit zwei Photonen Uncaging von Glutamat 13 erreicht, zu beschmutzen. Mit schnellen Mikro-Iontophorese ist es leicht möglich, zwei oder mehr iontophoretisches Pipetten verwenden und legen Sie sie in verschiedenen, auch weit entfernte Punkte auf der dendritischen Baum. Auf diese Weise läßt sich der Einbau von exzitatorischen Ereignisse, einschließlich der aus den verschiedenen Wegen, untersucht werden. Es ist auch möglich, eine Glutamat und GABA gefüllten Pipette iontophoretischen gleichzeitig verwenden. Auf diese Weise wird die Wirkung von GABA-erge Hemmung an verschiedenen Orten relativ zu der exzitatorischen Eingang (on-Pfad, außerhalb des Weges Hemmung) untersucht werden können. Auch die Auswirkungen der Hemmung durch Interneurone auf bestimmte neuronale Domains, wie distalen Dendriten, Soma oder Axonen 14, untersucht mit GABA Iontophorese werden. In kultivierten Neuronen, bietet schnellen Mikro-Iontophorese die Möglichkeit, Investigate einzelne Synapse Verteilung und die elementaren Aspekte der Kommunikation von Synapsen in Neuronen in viel mehr Details 10,11.

In diesem Artikel zeigen wir im Detail, wie Glutamat und GABA Iontophorese für den Einsatz in akuten Hirnschnitten, die Untersuchung synaptischer Integration von erregenden und hemmenden Eingänge ermöglicht in Abhängigkeit der Eingabe Lage, Eingang Stärken und Timing, allein oder im Zusammenspiel zu etablieren. Wir weisen darauf hin, die Vorteile und Grenzen dieser Technik und wie man erfolgreich beheben.

Protocol

1. Systemanforderungen Mikroskop-System: Gut Visualisierung des Dendriten ist entscheidend. Falls vorhanden, verwenden Sie ein Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskop-System. In unseren Experimenten verwendeten wir eine TRIM Scope II, LaVision Biotec, Bielefeld, Deutschland oder Ultima IV-System, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin mit einem Ti ausgestattet: Sapphire ultraschnelle-gepulste Laser (Chameleon Ultra II, Coherent) und eine hohe NA Ziel (60X, 0,9 NA, Olympus) zur Visualisierung der Dendriten,…

Representative Results

Ein einfacher Ansatz, um die räumliche Ausdehnung der Iontophorese zu bestimmen ist, um den iontophoretischen Pipette schrittweise von Dendriten zurückzuziehen, während die ausgeworfene Glutamat konstant. Wir fanden, dass die räumliche Ausdehnung eines Mikro-iontophoretischen Stimulation einen Durchmesser von etwa 12 um (Fig. 1, Radius) hat. Wie tief in das Gewebe der Iontophorese verwendet werden kann, hängt von der Steifigkeit der Pipette. Doch die iontophoretisches Pipetten für Experimente in S…

Discussion

Hier erklären wir, wie man schnell Mikro-Iontophorese von Neurotransmittern gelten synaptischen Integration auf Dendriten zu untersuchen. Diese Technik wurde erfolgreich eingesetzt, um glutamatergen und GABAergen synaptischen Übertragung in verschiedenen Hirnregionen in vitro und in vivo zu untersuchen 9,20-22. Micro-Iontophorese ist seit mehr als 60 Jahren verwendet worden, aber in den frühen Jahren war es meist verwendet, um entweder lokal gelten Neurotransmittern und Drogen bei langsam…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Hans Reiner Polder, Martin Fuhrmann und Walker Jackson für das sorgfältige Lesen des Manuskripts. Die Autoren erhalten, die Finanzierung durch das Ministerium für Forschung MIWF des Landes Nordrhein-Westfalen (SR), der BMBF-Projekträger DLR deutsch-amerikanischen Zusammenarbeit in Computational Neuroscience (CRCNS; SR) zur Verfügung gestellt wurde, Centers of Excellence in Neurodegenerative Erkrankungen (COEN; SR) und der Universität Bonn intramural Förderprogramm (BONFOR; SR).

Materials

      Material
Two-photon laser scanning microscope (TRIM Scope II), and Ultima IV, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin) LaVision Biotec, Bielefeld, Germany    
Two-photon laser scanning microscope Ultima IV Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin, USA    
Ti:Sapphire ultrafast-pulsed laser Chameleon Ultra II, Coherent    
60X Objective, NA 0.9 Olympus    
Zeiss Axioskop 2 FS upright microscope TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany    
Monochromator TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany    
Micro-iontophoresis system MVCS-02 NPI Electronics, Tamm, Germany    
Sutter puller P-97 Sutter Instrument Company, Novato, CA    
Glass filaments (150 GB F 8P) Science Products, Hofheim, Germany    
      Reagent
Alexa Fluor 488 hydrazide Molecular Probes life technologies A-10436  
Alexa Fluor 594 Molecular Probes life technologies A-10438  
NaCl Sigma Aldrich S7653  
KCl Sigma Aldrich P9333  
NaH2PO4 Sigma Aldrich S8282  
NaHCO3 Sigma Aldrich S6297  
Sucrose Sigma Aldrich S7903  
CaCl2 Sigma Aldrich C5080  
MgCl2 Sigma Aldrich M2670  
Glucose Sigma Aldrich G7528  
K-Gluconate Sigma Aldrich G4500  
HEPES-acid Sigma Aldrich H4034  
Phosphocreatin Sigma Aldrich P7936  
EGTA Sigma Aldrich E3889  
Glutamic acid Sigma Aldrich G8415  
GABA Sigma Aldrich A5835  
NaOH Merck 1.09137.1000  
HCl Merck 1.09108.1000  

References

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Cite This Article
Müller, C., Remy, S. Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration. J. Vis. Exp. (77), e50701, doi:10.3791/50701 (2013).

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