Summary

Microdissezione laser di neuroni da cellule differenziate Neuroprogenitor umani in coltura

Published: September 16, 2013
doi:

Summary

Cellule neuroprogenitor umane (NPC) sono stati ampliati in condizioni proliferanti. NPC sono stati differenziati in colture ricche di neuroni in presenza di una combinazione di neurotrofine. Marcatori neuronali sono state rilevate mediante immunofluorescenza. Per isolare una popolazione pura di neuroni, NPC sono stati differenziati sulla penna scivoli di membrana e cattura microdissezione laser è stata eseguita.

Abstract

Cellule Neuroprogenitor (NPC) isolati dal cervello fetale umano sono stati espansi in condizioni proliferative in presenza del fattore di crescita epidermico (EGF) e fattore di crescita dei fibroblasti (FGF) per fornire un rifornimento abbondante di cellule. NPC sono state differenziate in presenza di una nuova combinazione di fattore di crescita nervosa (NGF), cervello-derivato fattore neurotrofico (BDNF), dibutirril cAMP (DBC) e acido retinoico su piatti rivestito con poli-L-lisina e mouse laminina per ottenere neurone -ricche culture. NPC sono stati differenziati anche in assenza di neurotrofine, DBC e acido retinoico e in presenza di fattore neurotrofico ciliare (CNTF) per produrre colture ricche di astrociti. NPC dissociati sono stati caratterizzati da immunofluorescenza per un pannello di marcatori neuronali tra cui NeuN, synapsin, acetilcolinesterasi, synaptophysin e GAP43. Proteina acidica fibrillare gliale (GFAP) e STAT3, marcatori astrociti, sono stati rilevati nel 10-15% dei NPC differenziati. Per facilitaretipo cellulare caratterizzazione molecolare specifico, cattura microdissezione laser è stata eseguita per isolare neuroni coltivati ​​su polietilennaftalato (PEN) scorre membrana. I metodi descritti in questo studio forniscono strumenti preziosi per far progredire la nostra comprensione dei meccanismi molecolari della neurodegenerazione.

Introduction

Vita lunga neurogenesi si verifica nella zona subventricular dei ventricoli laterali e nello strato subgranulare del giro dentato dell'adulto cervello dei mammiferi 1. Cellule Neuroprogenitor (NPC) che provengono da queste regioni sono cellule multipotenti che possono differenziarsi in neuroni, astrociti e oligodendrociti 2. NPC hanno generato interesse a causa del loro potenziale per essere trapiantate nei pazienti affetti da varie patologie neurodegenerative tra cui il morbo di Parkinson, la sclerosi laterale amiotrofica, ictus e malattie (AD) 3 di Alzheimer. Studi con NPC sono generalmente concentrati su questo angolo trapianto ma il potenziale di neuroni NPC-derivati ​​come modello di coltura cellulare per determinare il meccanismo di neurodegenerazione non è stato sfruttato appieno. Studi precedenti hanno generalmente utilizzato neuroni post-mitotici isolate da tessuti cerebrali roditore che devono essere isolati per ogni esperimento in quanto non sonoauto-rigenerante. Anche se le linee di cellule di neuroblastoma umano SH-SY5Y compreso e le cellule SK-N-MC può essere ampliato, non hanno le caratteristiche di neuroni primari. NPC umani, invece, offrono vantaggi sia perché possono essere espansi per passaggi multipli e possono essere differenziate per generare una popolazione di cellule con le caratteristiche di neuroni primari 4,5. In questo studio, descriviamo un nuovo protocollo di differenziazione per ottenere una popolazione ricca di neuroni coerente da NPC disponibili in commercio isolati da cervello fetale umano. Poiché queste culture contengono una piccola percentuale di cellule gliali, dobbiamo metodi aggiuntivi per isolare una popolazione pura di neuroni per la caratterizzazione molecolare. Microdissezione laser (LCM) è un romanzo tecnica mediante la quale una popolazione omogenea di cellule da una sezione di tessuto può essere selettivamente catturato per analisi di espressione genica 6. Il cervello è un tessuto eterogeneo costituito da neuroni, glia e altri ty cellapes. LCM è stato usato per determinare l'espressione genica specifica del neurone analisi 7-10. Abbiamo già effettuato LCM di neuroni dell'ippocampo da AD (Tg2576) sezioni di cervello del mouse per visualizzare diminuita espressione di ciclico elemento di risposta AMP binding protein (CREB) e BDNF specificamente in neuroni dell'ippocampo 11. Nel presente studio, si descrivono le procedure per l'espansione della NPC umani, la differenziazione neuronale, immunofluorescenza per i marcatori neuronali e LCM per l'isolamento dei neuroni coltivati ​​su PENNA diapositive membrana.

Protocol

1. Ampliamento della NPC umani (Figura 1) Revive lo stock congelati di NPC umani da cervello fetale (Lonza, Walkersville, MD, USA) e la cultura in sospensione in T-75 palloni come neurosfere (Figura 1A) in mezzo Neurobasal contenenti integratori proliferazione, EGF (10 ng / ml) e FGF (10 ng / ml). Dopo 3 giorni di coltura, trasferire le neurosfere una provetta da 15 ml e centrifugare a 500 rpm per 5 min. Eliminare il supernatante lasciando dietro ~ 100 mic…

Representative Results

Ampliamento della NPC (Figura 1) Quando neurosfere sono ripartiti per una singola sospensione cellulare da triturazione, la punta della pipetta deve toccare il fondo della provetta in modo che vi sia una certa resistenza quando la sospensione è pipettati su e giù. Il numero di volte di triturazione può variare tra individui e deve essere decisa per tentativi ed errori esaminando la sospensione cellulare risultante sotto un microscopio. È importante fornire sufficiente densi…

Discussion

Descriviamo in questo studio un ricco di neurone modello di coltura cellulare per la differenziazione delle cellule autorinnovanti neuroprogenitor umani e un metodo per isolare una popolazione pura di neuroni cattura microdissezione laser. Abbiamo utilizzato una combinazione di NGF, BDNF, DBC e acido retinoico per la differenziazione neuronale di NPC. DBC viene utilizzato per attivare CREB, un fattore di trascrizione che migliora neurogenesi 12. L'acido retinoico induce uscita dal ciclo cellulare e riduce…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dalla concessione Merit Review (NEUD-004-07F) dal Veterans Administration (SP).

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
Neuroprogenitor cells (NPCs) Lonza PT-2599
Neurocult NS-A human basal medium Stem cell technology 5750
Neurocult NS-A Proliferation supplement Stem cell technology 5753
Neurocult NS-A Differentiation supplement Stem cell technology 5754
B-27 Supplement (50x) Invitrogen 17504-044
Human epidermal growth factor Stem cell technology 2633
Fibroblast growth factor Sigma F0291
Brain Derived Neurotrophic Factor Cell signaling 3897S
Nerve Growth Factor Invitrogen 13257-019
Dibutyryl cyclic AMP Sigma D-0627
poly-L-lysine Sigma P-5899
Mouse laminin Sigma L-2020
Retinoic acid Sigma R-2625
STAT3 antibody Cell signaling 9132
GFAP antibody Cell signaling 3670
GAP43 antibody Transduction laboratories 612262
BDNF antibody Millipore AB1534SP
Acetyl cholinesterase antibody Santz cruz Sc-11409
Synaptophysin antibody Abcam ab18008-50
NeuN antibody Chemicon MAB377
Synapsin antibody Novus NB300-104
Anti mouse FITC Jackson Immuno 115-095-146
Research Laboratories
Anti Rabbit Cy3 Jackson Immuno 711-165-152
Research Laboratories
BSA Sigma A1653
Triton-X 100 Acros 21568-2500
Paraformaldehye Fisher 4042
Coverslip (Big circle cover slip) Fisherbrand 12-545-102
Mounting medium (Prolong Gold) Invitrogen P36930
Pen membrane Applied biosystems LCM0521
Histogene LCM frozen section staining kit Applied biosystems KIT0401
RiboAmp RNA Amplification kit Applied biosystems KIT0201
Picopure RNA Isolation kit Applied biosystems KIT0202
CapsureMacro LCM caps Applied biosystems LCM0211

References

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Cite This Article
Bouchard, R., Chong, T., Pugazhenthi, S. Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture. J. Vis. Exp. (79), e50487, doi:10.3791/50487 (2013).

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