문화의 차별화 된 인간 Neuroprogenitor 세포에서 신경 세포의 레이저 캡처 미세 절제
Summary
인간 neuroprogenitor 세포 (NPC들)은 증식 조건 하에서 확장 하였다. 의 NPC는 neurotrophins과의 조합의 존재에 신경이 풍부한 문화로 분화되었다. 신경 세포 마커는 면역 형광 염색으로 검출되었다. 뉴런의 순수한 인구를 분리하기 위해,의 NPC는 PEN 막 슬라이드에 차별화 된 레이저 캡처 미세 절제를 행 하였다.
Abstract
인간 태아의 뇌에서 분리 Neuroprogenitor 세포 (NPC들)는 표피 성장 인자 (EGF) 및 세포의 풍부한 공급을 제공하는 섬유 아세포 성장 인자 (FGF)의 존재하에 증식 조건 하에서 확장 하였다. 의 NPC는 신경 성장 인자 (NGF)의 새로운 조합의 존재하에 분화 된, 뇌 유래 신경 영양 인자 (BDNF), dibutyryl 캠프 (DBC) 및 폴리-L-라이신 및 마우스 라미닌 코팅 접시에 레티노 산은 신경 세포를 얻는 풍부한 문화. NPC들도 neurotrophins과의 부재, DBC 및 레티노 산 및 성상 세포가 풍부한 배양을 수득 모양체 신경 영양 인자 (CNTF)의 존재하에 분화되었다. 차별화의 NPC는 노이 앤, synapsin, 아세틸 콜린, 시납과 GAP43 등의 신경 세포 마커의 패널에 대한 면역 형광 염색을 특징으로했다. 아교 섬유 성 산성 단백질 (GFAP)와 STAT3, 성상 세포 마커는 차별화 된 NPC의 10 ~ 15 %가 검출되었다. 용이하게하기 위해셀 타입의 특정 분자 특성은 레이저 캡처 미세 절제는 폴리에틸렌 나 프탈레이트 (PEN) 막 슬라이드에서 배양 신경 세포를 분리 하였다. 이 연구에서 설명하는 방법은 신경 퇴행의 분자 메커니즘에 대한 우리의 이해를 사전에 가치있는 도구를 제공합니다.
Introduction
평생 신경은 측면 심실의 subventricular 영역과 성인 포유류의 뇌 (1)의 치아 이랑의 subgranular 층에서 발생하는 것으로 알려져 있습니다. Neuroprogenitor 세포 (NPC들)이이 지역에서 발생이 신경 세포, 성상 세포 및 희소 돌기 아교 세포 (2)로 분화 할 수있는 다 능성 세포입니다. NPC들 때문에 파킨슨 병, 근 위축성 측삭 경화증, 뇌졸중, 알츠하이머 병 (AD) 3 등 다양한 퇴행성 신경 질환을 가진 환자에 이식 할 잠재력의 관심을 생성했다. 의 NPC와 연구는 일반적으로 이식 각도에 집중했지만 신경 퇴행의 메커니즘을 결정하는 세포 배양 모델로서 NPC 유래 신경의 전위는 충분히 이용되지 않았다. 그렇지 않은으로 이전 연구는 일반적으로 각 실험에 대한 격리 할 필요가 쥐의 뇌 조직에서 분리 된 후 유사 분열 신경을 사용했습니다자기 갱신. SH-SY5Y 및 SK-N-MC 세포를 포함한 인간 신경 아세포종 세포주는 확장 될 수 있지만, 그들은 차 신경의 특성이 없다. 그들은 여러 계대 확장 될 수 있고, 차 뉴런 4,5의 특성과 함께 세포 집단을 생성하기 위해 구별 될 수 있기 때문에 인간의 NPC는 반면에, 양쪽의 이점을 제공한다. 현재의 연구에서, 우리는 인간 태아의 뇌에서 분리 된 시판의 NPC에서 일관성있는 신경 세포의 풍부한 인구를 얻기 위해 새로운 분화 프로토콜을 설명합니다. 이러한 문화가 glial 세포의 작은 퍼센트를 포함 않기 때문에, 우리는 분자 특성에 대한 신경 세포의 순수한 인구를 분리하기 위해 추가적인 방법이 필요합니다. 레이저 캡처의 microdissection (LCM)는 조직 절편에서 세포의 동종 집단을 선택적으로 유전자 발현 분석 (6)에 대해 포착 될 수있는 새로운 기술이다. 뇌는 신경 세포, 아교 및 다른 세포 타이로 구성된 이종 조직이다PES. LCM은 신경 세포 특이 유전자의 발현을 결정하는 데 사용되었다 70-10을 분석한다. 우리는 이전에 구체적으로 해마의 신경 세포 11 감소 사이 클릭 AMP 반응 요소 결합 단백질의 발현 (CREB)과 BDNF를 보여 AD (Tg2576) 마우스 뇌 섹션에서 해마의 뉴런의 LCM을 수행했습니다. 본 연구에서는 PEN 막 슬라이드에서 배양 된 신경 세포의 분리에 대한 인간의 NPC의 확장, 신경 세포의 분화, 신경 세포 마커에 대한 면역 형광 염색 및 LCM에 대한 절차를 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는이 연구에서 자기 갱신 인간 neuroprogenitor 세포의 분화에 의해 신경 세포가 풍부한 세포 배양 모델과 레이저 캡처 미세 절제에 의해 신경 세포의 순수한 인구를 분리하는 방법을 설명합니다. 우리는 NGF, BDNF, DBC와의 NPC의 신경 세포 분화 레티노 산의 조합을 사용했습니다. DBC는 CREB, 신경 (12)를 강화하는 전사 인자를 활성화하는 데 사용됩니다. 레티노 익산은 세포주기의 종료를 유도?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 (SP에) 재향 군인회에서 공로 검토 교부금 (NEUD-004-07F)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Neuroprogenitor cells (NPCs) | Lonza | PT-2599 | |
| Neurocult NS-A human basal medium | Stem cell technology | 5750 | |
| Neurocult NS-A Proliferation supplement | Stem cell technology | 5753 | |
| Neurocult NS-A Differentiation supplement | Stem cell technology | 5754 | |
| B-27 Supplement (50x) | Invitrogen | 17504-044 | |
| Human epidermal growth factor | Stem cell technology | 2633 | |
| Fibroblast growth factor | Sigma | F0291 | |
| Brain Derived Neurotrophic Factor | Cell signaling | 3897S | |
| Nerve Growth Factor | Invitrogen | 13257-019 | |
| Dibutyryl cyclic AMP | Sigma | D-0627 | |
| poly-L-lysine | Sigma | P-5899 | |
| Mouse laminin | Sigma | L-2020 | |
| Retinoic acid | Sigma | R-2625 | |
| STAT3 antibody | Cell signaling | 9132 | |
| GFAP antibody | Cell signaling | 3670 | |
| GAP43 antibody | Transduction laboratories | 612262 | |
| BDNF antibody | Millipore | AB1534SP | |
| Acetyl cholinesterase antibody | Santz cruz | Sc-11409 | |
| Synaptophysin antibody | Abcam | ab18008-50 | |
| NeuN antibody | Chemicon | MAB377 | |
| Synapsin antibody | Novus | NB300-104 | |
| Anti mouse FITC | Jackson Immuno | 115-095-146 | |
| Research Laboratories | |||
| Anti Rabbit Cy3 | Jackson Immuno | 711-165-152 | |
| Research Laboratories | |||
| BSA | Sigma | A1653 | |
| Triton-X 100 | Acros | 21568-2500 | |
| Paraformaldehye | Fisher | 4042 | |
| Coverslip (Big circle cover slip) | Fisherbrand | 12-545-102 | |
| Mounting medium (Prolong Gold) | Invitrogen | P36930 | |
| Pen membrane | Applied biosystems | LCM0521 | |
| Histogene LCM frozen section staining kit | Applied biosystems | KIT0401 | |
| RiboAmp RNA Amplification kit | Applied biosystems | KIT0201 | |
| Picopure RNA Isolation kit | Applied biosystems | KIT0202 | |
| CapsureMacro LCM caps | Applied biosystems | LCM0211 |
References
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