Summary

התמרה adenoviral של CD4 תמימים תאי T ללמוד בידול Treg

Published: August 13, 2013
doi:

Summary

העברת גני adenoviral לתוך CD4 נאיבי תאי T מהונדס עם ביטוי של הקולטן אדנווירוס Coxsackie מאפשרת ניתוח המולקולרי של התמיינות תאי T רגולטורים<em> במבחנה</em>.

Abstract

תאי T רגולטוריים (Tregs) הם חיוניים כדי לספק סובלנות חיסונית עצמי, כמו גם לאנטיגנים זרים מסוימים. יכול להיות שנוצר Tregs מתאי T מסוג CD4 נאיביים במבחנה עם TCR-ושיתוף גירוי בנוכחות TGFβ ו-IL-2. זה נושא פוטנציאל עצום לטיפולים עתידיים, לעומת זאת, המולקולות ומסלולי איתות שבידול שליטה הם במידה רבה לא ידועים.

ניתן להשפיע תאי T עיקריים דרך ביטוי גנים מחוץ לרחם, אך שיטות נפוצות אינן מצליח למקד את המדינה הנאיבית החשובה ביותר של תא T לקראת הכרת אנטיגן העיקרית. כאן, אנו מספקים פרוטוקול לבטא גנים מחוץ לרחם בתאי T מסוג CD4 נאיביים במבחנה לפני גרימת בידול Treg. היא חלה התמרה עם אדנווירוס כפול המחסר ומסבירה הדור והייצור שלה. אדנווירוס יכול לקחת עד מחדיר גדול (עד 7 קילו) והוא יכול להיות מצויד עם יזמים כדי להשיג overexp הגבוהה והחולףression בתאי T. זה למעשה transduces תאי T עכבר נאיביים אם הם מבטאים רצפטור אדנווירוס Coxsackie מהונדס (מכונית). חשוב מכך, לאחר הדבקת תאי T נשארים נאיביים (CD44 נמוך, CD62L גבוהה) ומנוחה (CD25 -, CD69 -) ויכול להיות מופעל ומובחן לTregs דומה לתאים שאינם נגועים. לכן, שיטה זו מאפשרת מניפולציה של CD4 התמיינות תאי T מראשיתו. זה מבטיח כי ביטוי גנים מחוץ לרחם כבר נמצא במקום כאשר אירועי איתות ראשונים של גירוי TCR הראשוני גורם לשינויים תאיים שסופו של דבר יובילו לבידול Treg.

Introduction

Tregs הם חיוניים כדי לשמור על סבילות חיסונית ולצנן את התגובות חיסוניות להחטיא. Tregs לדכא הפעלת תא T עובר אורח. כתוצאה מכך, אבלציה של Tregs מובילה לאוטואימוניות הקטלנית והרס עצמי מונעת על ידי תאי T מופעל 1. Tregs להתפתח בבלוטת התימוס במהלך סלקציה שלילית של CD4 מבשרים אחת חיובי, אבל הם גם יכולים להבחין בפריפריה מתאי T מסוג CD4 תמימים על גירוי אנטיגן במינון נמוך עם 1,2 שיתוף הגירוי הכי מוצלח. נראה הרתי Tregs לדכא אוטואימוניות רקמה נגד-אנטיגנים עצמיים, ואילו ההיקפי Tregs היו מעורב במתן סובלנות במעי או הריאה. המושרה Tregs אלה potently למנוע הפעלת תא T לאחר הכרה של אנטיגנים זרים ברירית, כולל אנטיגנים סביבתיים ממזון והאוויר, חיידקי commensal, ואלרגנים 3,4. בנוסף, Tregs הם קריטיים להקמת סובלנות אימהית לעובר 5 פפטידים ומראשמחלת שתל נגד מארח פורקן 6. במקביל, גם Tregs לתווך לוואי בלתי רצוי על ידי הפחתת ערך מעקב חיסונית של תאים סרטניים 7,8. תכונת ההיכר של Tregs היא הביטוי של-משנה ציון FOXP3 גורם השעתוק, גורם שעתוק המכיל תחום המזלג בראש, כי הוא הכרחי ומספיק להעניק Treg פונקציה 9,10. כמה מסלולי איתות שיכול לגרום ביטוי FOXP3 ידועים. עם זאת, התהליכים המולקולריים השליטה, להסדיר, או לווסת Treg בידול בתגובה לקולטן תא T מפעילה הם הבינו פחות טובים.

יכול מאוד יעיל להיגרם Tregs במבחנה על ידי הגירוי של תאי T מסוג CD4 נאיביים עם נוגדנים אנטי CD3 ואנטי CD28 בנוכחות TGFβ ו-IL-2 11. כTregs מתעורר הם פונקציונליים in vivo, המניפולציה של מולקולות המקדמות בידול Treg נושא פוטנציאל עצום לעתיד therapies, למשל, טיפול באסתמה, מחלת Crohns, והשתלת 11,12. לעומת זאת, אפנון טיפולי של מולקולות כדי לחסום בידול Treg עשוי לספק תועלת בגישות עתידיות של טיפול המשולב של חולי סרטן.

במבחני בידול במבחנה כבר סייע לתיאור של שינויים מולקולריים הקשורים להתמיינות תאי T משנה. באותו הרגע, ניסיונות ניסיוניים לחיפוש או מסך למוצרי גן שהתמיינות תאי T שליטה הם הקשו על ידי העובדה שהשיטות הנפוצות ביותר של ביטוי גנים מחוץ לרחם להיכשל בתאי T נאיביים. לדוגמה, electroporation ותמרת retroviral הם יעילים רק בתאי T מופעלים. בניגוד לציפיות ראשוניות, תמרת lentiviral, שהוא בדרך כלל יעיל בתאי מנוחה, דורשת מראש הפעלה של תאי T נאיביים ידי ציטוקינים 13. יתר על כן, ההעברה של cDNA או mRNA במהלך electroporationכרוך בשלילת קוטביות של קרום הפלזמה, שהיא עצמה מעניקה תכונות של הפעלת תאי T ואולי אף לגייס Ca 2 + איתות ולהפעיל את חלבוני NFAT (תצפית ושופט שלא פורסם. 14). באופן דומה, לתמרת retroviral, תאי T הנאיביים צריכים להיות מופעלים עבור 18 – 40 שעות. במהלך תקופה זו, הפירוט של קרום הגרעין במהלך חלוקת תא מתרחש, ומאפשר לשילוב הגנומי הבא של וקטור retroviral 15. שיטות אלה אינם מסוגלים להתמודד עם הרגולציה המולקולרית המוקדמת של מפגש ראשוני עם תא T אנטיגן, המהווה את השלב המכריע של התמיינות תאי T מסייע.

התמרה adenoviral ידועה להעניק ביטוי גנים מחוץ לרחם חולף במספר סוגי תאים האנושיים המבטאים את הקולטן אדנווירוס Coxsackie האנושי (מכונית). הוא ממשיך ללא דרישה להפעלת תא או התקדמות מחזור התא. משטח הביטוי של גAR הוא חיוני לקובץ מצורף וירוס יעיל והפנמה, וביטוי מהונדס של הגרסה המקוצצת CARΔ1 תחת אמרגן תא ספציפי T נמצא כדי להבהיר thymocytes העכבר ותאי T הרגישים לזיהום adenoviral 16. חשוב לציין, transgene אינו משנה thymocyte פיתוח או בבידול מבחנה של CD4 תאי T נאיבי לתוך תת שונים (מידע לא מוצג; נ"צ 17.). התמרה אדנווירוס בתיווך של תאי T ששימש בעבר לביטוי יתר 17,18 ועקום למטה גישות 19,20. יכולים להיות מטוהרים תאי T המהונדס מזמין מסחרי DO11.10 TG; CARΔ1 TG (Taconic, Inc ונ"צ 17.). חשוב לציין, התמרה adenoviral מאפשרת ביטוי גבוה של גן של עניין בתאי T נאיביים ללא גרימת סימנים ברורים של הפעלה. תאי ה-T נשארים נאיביים (CD44 נמוך, CD62L גבוהה) ומנוחה (CD25 -, CD69 -) לאחר infectiוביכול להיות מופעל ומובחן לTreg דומה לתאים שאינם נגועים.

ייצור של adenoviruses רקומביננטי יכול להיות מושגת לאחר transfection של תאי HEK293A עם פלסמידים adenoviral (איור 1). פלסמידים אלה מכילים בדרך כלל את הגנום האנושי אדנווירוס מסוג 5 עם גני E1 ו-E3 שנמחקו כדי להבהיר adenoviruses רקומביננטי שכפול פסול 21. תאי HEK293A להשלים מחסור שכפול כפי שהם כבר הונצחו באמצעות שילוב יציב של אדנווירוס טעון 22. מאז וקטורי adenoviral גדולים (~ 40 KB) וכתוצאה מכך לא מתאים גם לשיבוט בתיווך אנזים הגבלה מסורתי, אנחנו עובדים במערכת השער. הגן של עניין הוא משובט תחילה לתוך וקטור כניסה קטן יותר, שממנו ניתן להעביר אותו בקלות לתוך וקטור יעד adenoviral דרך תגובת רקומבינציה מבדה (LR) 23. אנחנו בניתי את וקטור pCAGAdDuעל ידי שילוב של אמרגן CAG (אמרגן אקטין עוף ומשפר CMV) עם קלטת ביטוי המכילה אתרי LR איגוף סמן בחירת ccdB procaryotic 24. קלטת ביטוי זה התמזגה לאתר פנימי כניסה הריבוזום (IRES) רכיב המאפשר coexpression של החלבון אוקריוטים זיהום הסמן המשופר הירוק הניאון (eGFP), אשר התמזג רצף המכיל הורמון גדילת פולי השור () אות. אנחנו בחרנו את רצפי cis-הרגולציה חטיבת כלי טיס, שכן אמרגן CMV prototypic נמצא להיות מאוד הפעלה תלויה ושלילי ולכן לביטוי גנים בתאי T נאיביים.

כאן, אנו מספקים פרוטוקול להתמיינות יעילה בTreg מבחנה ושיטה לtransduce תאי T מסוג CD4 תמימים ללא הפעלה (איור 2). השיטה מאפשרת ביטוי אקטופי גן או להפיל מסוג CD4 שקדמו התמיינות תאי T במצב הנאיבי. זה מאפשר לבחון את ההשפעה של overexpresseגן ד של ריבית במהלך אירועי איתות ראשונים על גירוי ראשוני TCR עד מחויבות משנה תא T. ניסויי האימות שלנו גם מספקים את הבסיס להקמת יישום דומה באדנווירוס הבידול של תת קבוצות אחרות כגון תאי T Th1, Th2, Th9, Th17, Th22, או תאי TFH.

Protocol

1. שיבוט של גן של עניין לוקטור כניסה לשבט את הגן של עניין לוקטור כניסה. ההגברה PCR של הגן ואחרי קשירה בוטה סוף לתוך וקטור topoisomerase מצמידים (למשל pENTR / D-TOPO) או הגבלת אנזים בתיווך שיבוט עשוי לשמש להליך זה. <p class="jove_title"…

Representative Results

ייצור וירוס עבור דור של titers וירוס גבוה, העיתוי של מסיק תא HEK293A בייצור וירוס ראשוני או הגברה וירוס הוא קריטי. תמונות עם ניגודיות ניאון ושלב נציג עם סימנים חזותיים של ייצור נגיף מוצגות באיור 3. CPE נצפו 10 ימים לאחר transfection של תאי …

Discussion

דור וירוס וטיטרציה

לקבלת תוצאות אופטימליות transfection, האיכות והכמות של וקטור לינארית מופיעות חשוב ביותר. אנו לא צופים השפעה שלילית על ייצור lysate עיקרי מצמיחת יתר ראשונית של התרבות מאז הזיהום ימשיך במהירות ברגע ייצור וירוס יעיל מתרחש. …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מבקשים להודות לLirui דו לבניית וקטור pCAGAdDU ואוליבר גורקה למתן פרוטוקול הקיבעון.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number
pENTR/D-TOPO Cloning Kit Invitrogen K240020
Gateway LR Clonase II Enzyme mix Invitrogen 11791020
PacI New England Biolabs R057S
jetPEI Polyplus-transfection 101-10N
HEK293A Cell Line Invitrogen R705-07
A549 ATCC CCL-185
6-well plates BD Falcon 353046
14 cm tissue culture dish Nunc 168381
BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CARΔ1)1Jdgr Taconic Farms Model Nr. 4285
Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II Miltenyi Biotech 130-094-131
DMEM Invitrogen 41966-052
FBS PAN Biotech 1502-P110704
PenStrep Invitrogen 15140-122
RPMI 1640 Lonza BE12-167F
NaPyruvate Lonza BE13-115E
NEAA 100x Lonza BE13-114E
L-Glutamine Invitrogen 25030
HEPES Buffer Solution (1 M) Invitrogen 15630-056
β-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M-7522
MEM Essential vitamin mixture (100x) Lonza 13-607C
Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 for Cell Expansion and Activation Invitrogen 114-56D
Recombinant Human TGF-beta 1 R&D Systems 240B
Proleukin S (18 x 106IE) Novartis  
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit Invitrogen L-23105
Mouse BD Fc BlockT BD Pharmingen 553141
Anti-Mouse/Rat Foxp3 PE eBioscience 12-5773-82
Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA Assay Roche Applied Biosystems 4427975
LightCycler 480 Probes Master Roche Applied Biosystems 04902343001
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit Roche Applied Biosystems 4366596

References

  1. Lahl, K., Loddenkemper, C., et al. Selective depletion of Foxp3+ regulatory T cells induces a scurfy-like disease. The Journal of Experimental Medicine. 204 (1), 57-63 (2007).
  2. Kretschmer, K., Apostolou, I., Hawiger, D., Khazaie, K., Nussenzweig, M. C., von Boehmer, H. Inducing and expanding regulatory T cell populations by foreign antigen. Nature Immunology. 6 (12), 1219-1227 (2005).
  3. Zhang, X., Izikson, L., Liu, L., Weiner, H. L. Activation of CD25(+)CD4(+) regulatory T cells by oral antigen administration. Journal of Immunology (Baltimore, Md). 167 (8), 4245-4253 (2001).
  4. Josefowicz, S. Z., Niec, R. E., et al. Extrathymically generated regulatory T cells control mucosal TH2 inflammation. Nature. 482 (7385), 395-399 (2012).
  5. Samstein, R. M., Josefowicz, S. Z., Arvey, A., Treuting, P. M., Rudensky, A. Y. Extrathymic generation of regulatory T cells in placental mammals mitigates maternal-fetal conflict. Cell. 150 (1), 29-38 (2012).
  6. Laurence, A., Amarnath, S., et al. STAT3 Transcription Factor Promotes Instability of nTreg Cells and Limits Generation of iTreg Cells during Acute Murine Graft-versus-Host Disease. Immunity. 37 (2), 209-222 (2012).
  7. Terabe, M., Berzofsky, J. A. Immunoregulatory T cells in tumor immunity. Current Opinion in Immunology. 16 (2), 157-162 (2004).
  8. Li, X., Kostareli, E., Suffner, J., Garbi, N., Hämmerling, G. J. Efficient Treg depletion induces T-cell infiltration and rejection of large tumors. European Journal of Immunology. 40 (12), 3325-3335 (2010).
  9. Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).
  10. Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).
  11. Chen, W., Jin, W., et al. Conversion of Peripheral CD4+CD25- Naive T Cells to CD4+CD25+ Regulatory T Cells by TGF-β Induction of Transcription Factor Foxp3. The Journal of Experimental Medicine. 198 (12), 1875-1886 (2003).
  12. Xu, W., Lan, Q., et al. Adoptive transfer of induced-treg cells effectively attenuates murine airway allergic inflammation. PloS ONE. 7 (7), e40314 (2012).
  13. Circosta, P., Granziero, L., et al. T cell receptor (TCR) gene transfer with lentiviral vectors allows efficient redirection of tumor specificity in naive and memory T cells without prior stimulation of endogenous TCR. Human Gene Therapy. 20 (12), 1576-1588 (2009).
  14. Patel, C., Muthuswamy, J. High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA). J. Vis. Exp. (67), e4415 (2012).
  15. Zhong, S., Malecek, K., Perez-Garcia, A., Krogsgaard, M. Retroviral transduction of T-cell receptors in mouse T-cells. J. Vis. Exp. (44), e2307 (2010).
  16. Leon, R. P., Hedlund, T., et al. Adenoviral-mediated gene transfer in lymphocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (22), 13159-13164 (1998).
  17. Wan, Y. Y., Leon, R. P., et al. Transgenic expression of the coxsackie/adenovirus receptor enables adenoviral-mediated gene delivery in naive T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13784-13789 (2000).
  18. Hurez, V., Dzialo-Hatton, R., Oliver, J., Matthews, R. J., Weaver, C. T. Efficient adenovirus-mediated gene transfer into primary T cells and thymocytes in a new coxsackie/adenovirus receptor transgenic model. BMC Immunology. 3, 4 (2002).
  19. Eitelhuber, A. C., Warth, S., et al. Dephosphorylation of Carma1 by PP2A negatively regulates T-cell activation. The EMBO Journal. 30 (3), 594-605 (2011).
  20. Glasmacher, E., Hoefig, K. P., et al. Roquin binds inducible costimulator mRNA and effectors of mRNA decay to induce microRNA-independent post-transcriptional repression. Nature Immunology. 11 (8), 725-733 (2010).
  21. Russell, W. C. Update on adenovirus and its vectors. The Journal of General Virology. 81 (Pt. 11), 2573-2604 (2000).
  22. Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C., Nairn, R. Characteristics of a Human Cell Line Transformed by DNA from Human Adenovirus Type 5. Journal of General Virology. 36 (1), 59-72 (1977).
  23. Landy, A. Dynamic, structural, and regulatory aspects of lambda site-specific recombination. Annual Review of Biochemistry. 58, 913-949 (1989).
  24. Bernard, P., Couturier, M. Cell killing by the F plasmid CcdB protein involves poisoning of DNA-topoisomerase II complexes. Journal of Molecular Biology. 226 (3), 735-745 (1992).
  25. Thai, T. -. H., Calado, D. P., et al. Regulation of the Germinal Center Response by MicroRNA-155. Science. 316 (5824), 604-608 (2007).
  26. Rodriguez, A., Vigorito, E., et al. Requirement of bic/microRNA-155 for Normal Immune Function. Science. 316 (5824), 608-611 (2007).
  27. Cobb, B. S., Hertweck, A., et al. A role for Dicer in immune regulation. The Journal of Experimental Medicine. 203 (11), 2519-2527 (2006).
  28. Steiner, D. F., Thomas, M. F., et al. MicroRNA-29 Regulates T-Box Transcription Factors and Interferon-γ Production in Helper T Cells. Immunity. , (2011).

Play Video

Cite This Article
Warth, S. C., Heissmeyer, V. Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation. J. Vis. Exp. (78), e50455, doi:10.3791/50455 (2013).

View Video