Naif CD4 adenoviral İletimi Treg Farklılaşma Eğitim Hücreler T

Tregs immün tolerans korumak ve aşılmaz bağışıklık yanıtları kırmak için çok önemlidir. Tregs seyirci T hücre aktivasyonu bastırmak. Sonuç olarak, Tregs ablasyon aktive T hücreleri ¹ ile tahrik ölümcül otoimmünite ve kendi kendini yok yol açar. Tregs CD4 tek pozitif öncüleri olumsuz seçimi sırasında timus gelişebilir, ama onlar da optimal ortak stimülasyon ^1,2 ile düşük doz antijen stimülasyonu üzerine naif CD4 T hücreleri çevre içinde ayırt edebilirsiniz. Periferik Tregs bağırsak ve akciğer hoşgörü sağlayan suçlanmıştır ise timik Tregs, kendini antijenlere karşı doku otoimmünite bastırmak gibi görünüyor. Bu bağlı Tregs kuvvetli gıda ve hava, ortakçı bakteri ve alerjenleri ^3,4 çevresel antijenleri dahil olmak üzere mukozada yabancı antijenleri, tanınması sonra T hücre aktivasyonu engeller. Buna ek olarak, Tregs fetal peptidler için anne toleransı ⁵ kurmak ve önceden için çok önemlihavalandırma graft-versus-host hastalığı ^6. Aynı zamanda, aynı zamanda ^7,8 Tregs tümör hücrelerinin immün gözetim alçaltarak istenmeyen etkilere aracılık eder. Tregs damgasını özelliği alt-belirterek transkripsiyon faktörü Foxp3, gerekli ve fonksiyon ^9,10 Treg görüşmek için yeterli bir çatal başlı etki alanı içeren transkripsiyon faktörü ifadesidir. Foxp3 ifade neden bazı sinyal yolları bilinmektedir. Bununla birlikte, kontrol, düzenler ya da tetikleyici T hücresi reseptörüne tepki olarak farklılaşma Treg modüle ettiğini moleküler süreçlerin daha iyi anlaşılmıştır.

Tregs çok etkili TGFβ ve IL-2, ¹¹ varlığında, anti-CD3 ve anti-CD28 antikorları ile naif CD4 + T hücrelerinin uyarılması ile in vitro olarak uyarılabilir. Gelişmekte olan Tregs in vivo, Treg farklılaşma teşvik moleküllerin manipülasyon fonksiyonel olduğu gibi gelecekte therapi için büyük bir potansiyel taşımaktadıres, örneğin, astım, Crohn hastalığı, transplantasyon ve ^11,12. Tersine, Treg farklılaşma engellemek için moleküllerin tedavi modülasyonu tümör hastaların kombine tedavi gelecekteki yaklaşımlar fayda sağlayabilir.

In vitro farklılaşma tayinlerde T hücre alt farklılaşma ile ilişkili moleküler değişikliklerin açıklaması için vesile olmuştur. Şu anda, ara ya da kontrol T hücre farklılaşmasını ektopik gen ifadesinin en yaygın yöntemler naif T-hücrelerinde başarısız olması nedeniyle engellenmektedir bu gen ürünlerinin taranması için deneysel çalışır. Örneğin, elektroporasyon ve retroviral transdüksiyon aktive edilmiş T-hücrelerinde etkilidir. Ilk beklentileri, dinlenme hücreler tipik olarak etkilidir lentiviral transdüksiyon, aksine, sitokinler ¹³ tarafından naif T hücrelerinin ön aktivasyon gerektirir. Ayrıca, elektroporasyon sırasında cDNA veya mRNA 'devrikendisi T hücre aktivasyonunun özellikleri kazandırır ve hatta ^{Ca2 +} sinyali harekete geçirebilir plazma zar, depolarizasyon içerir ve NFAT proteinler (yayınlanmamış gözlem ve ref. ¹⁴⁾ etkinleştirin. 40 saat – Benzer şekilde, retroviral transdüksiyon için, naif T hücreleri 18 için aktif olmak zorunda. Bu süre boyunca, hücre bölünmesi sırasında nükleer membran arıza meydana ve retroviral vektör ^15'in sonraki genomik entegrasyon için izin verir. Bu yöntemler bu nedenle yardımcı T hücre farklılaşmasının belirleyici aşamasıdır antijen ile ilk T hücre karşılaşma erken moleküler düzenleme ele mümkün değildir.

Adenoviral transdüksiyon, insan adenovirüs Coxsackie reseptörü (CAR) ifade, insan hücre tipleri arasında bir dizi geçici ektopik gen ekspresyonunu vermek bilinmektedir. Bu hücre aktivasyonu ya da hücre döngüsü ilerlemesi için gerek kalmadan devam eder. C yüzey ekspresyonuAR etkili bir virüs bağlanma ve içselleştirilmesi için gerekli olan ve bir T hücre-spesifik promotör altında kesilmiş versiyonunu CARΔ1 transgenik ekspresyonu adenoviral enfeksiyon ¹⁶ ile duyarlı bir fare timositleri ve T hücre oluşturmak bulunmuştur. Önemli olarak, transgen timosit gelişimi değiştirmeyen veya naif CD4 in vitro farklılaşma, farklı alt-grup halinde hücreleri (veriler gösterilmemiştir; ref ^17.) T. T hücrelerinin Adenovirüs aracılı transdüksiyon önce yaklaşımlar ^19,20 aşırı ^17,18 için kullanılan ve knock-down oldu. Transgenik T hücreleri ticari olarak temin DO11.10 TG arıtılabilir; CARΔ1 TG (Taconic, Inc ref ^17).. Önemli olarak, Adeno transdüksiyon aktivasyon belirgin belirtileri neden olmadan naif T-hücrelerinde, bir ilgi geninin yüksek sağlar. T hücreleri naif kalır (CD44 ^düşük, CD62L ^yüksek) ve dinlenme (CD25 ^-, CD69 ^-) sonra enfeksiyonuve enfekte olmayan hücrelere benzer Treg içine aktif ve ayırt edilebilir.

Rekombinant adenovirüsleri üretimi adenoviral plazmidi (Şekil 1) ile HEK293A hücre sırasında transfeksiyonundan sonra elde edilebilir. Bu plazmid genellikle çoğaltma-beceriksiz rekombinant adenovirüs ²¹ işlemek için silinir E1 ve E3 genleri ile insan tipi 5 adenovirüs genomu içerir. Onlar makaslanmış adenovirüs ²² istikrarlı entegrasyonu ile ölümsüzleştirdi edilmiş olarak HEK293A hücre çoğaltma eksikliği tamamlıyor. Adenoviral vektörlerin büyük (~ 40 kb) ve dolayısıyla iyi geleneksel kısıtlama enzim aracılı klonlama için uygun olmadığı için, biz Ağ Geçidi sistemi istihdam. İlgi konusu genin başlangıçta kolaylıkla lambda Rekombinasyon reaksiyonu (LR) ²³ yoluyla hedef adenoviral vektörü içine transfer edilebilir daha küçük bir giriş vektörü içine klonlanır. Biz pCAGAdDu vektör inşaprokaryotik ccdb seçim işaretleyici ²⁴ yan LR siteleri içeren bir ekspresyon kaseti ile CAG promoteri (tavuk aktin promotörü ve CMV artırıcı) birleştirerek. Bu ifade kaseti, büyükbaş hayvan büyüme hormonu poli (A) sinyal içeren bir diziye kaynaşmış olan ökaryotik enfeksiyon marker gelişmiş yeşil floresan protein (EGFP) arasında ekspresyonuna izin veren bir dahili ribozom giriş bölgesi (IRES) öğesi için eritilerek birleştirilir. Prototipik CMV promoteri yüksek aktivasyon bağımlı ve naif T hücrelerinde gen ekspresyonu için bu nedenle elverişsiz olduğu bulunmuştur beri, CAG cis-düzenleyici sekanslar seçtik.

Burada, in vitro Treg farklılaşmasında etkili bir protokol ve etkinleştirme (Şekil 2) olmadan naif CD4 + T hücrelerinin transdüksiyonu için bir yöntem sağlar. Yöntemi ektopik gen ekspresyonu sağlayan ya da naif devlet önceki CD4 T hücre farklılaşması yıkmak. Bir overexpresse etkisini test edilmesine olanak sağlarT hücre alt bağlılık kadar ilk TCR uyarılması üzerine erken sinyal olaylar sırasında ilgi d gen. Bizim doğrulama deneyleri de Th2 gibi Th1 gibi diğer T hücre alt grupları, TH9, Th17, Th22 veya TFH hücrelerin farklılaşması benzer adenovirüs uygulama kurmak için temel sağlar.