Geração de camundongos derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas

Este método foi utilizado na pesquisa relatada em Boland et al Nature.. 461, 91-96 (2009) 1. 1. Preparação de Lentivirus Este protocolo utiliza doxiciclina induzíveis por vectores vaivém lentivirais que codificam para Oct4, Sox2, Klf4, e c-Myc sob o controlo de um elemento de resposta de tetO. Os transgenes são activados pela tetraciclina reversa proteína trans-activação, rtTAM2.2 16, que induz a expressão do factor de reprogramação na presença de doxiciclina. Este sistema permite a expressão controlada rigidamente, elevada de factores de reprogramação. Os lentivirais usados ​​aqui são auto-inativadora e, portanto, não pode replicar integração genômica seguinte. No entanto, é necessária precaução quando se trabalha com lentivírus e deve ser realizado em conformidade com laboratórios BSL2 (EUA) e S2 (Europa) padrões. Descongele as células HEK293T e passagem pelo menos uma vez antes de transfection. As células devem ser mantidas a densidade confluentes em meio de HEK a 37 ° C, 5% de CO 2 num ambiente humidificado. Células de passagem rotineiramente a cada 2 dias, com uma razão de divisão de 1:06 – 01:10. Semente ~ 8 x 10 6 HEK293T cells/T150 meio com 25 ml de HEK. Usar um T150 para cada preparação lentivirus. No dia seguinte, transfectar células HEK293T por precipitação com fosfato de cálcio. (Nota: nas nossas mãos de precipitação com fosfato de cálcio resulta rotineiramente em eficiência de transfecção de 80-90%, no entanto, reagentes lipídicos catiónicos de transfecção, tais como Lipofectamina 2000 também pode ser utilizado). Preparar dois tubos cónicos de 15 ml para cada virus a ser preparada. Rotular os tubos "A" e "B". Tubo A, 10 ug de cada um: os lentivirais shuttle vector codificando factores de reprogramação (ou rtTAM2.2), os vectores virais de empacotamento, e plasmídeo que codifica a proteína do envelope viral, VSVg. Adicionar 186 ul de 2 M de CaCl2 para tubo A, e levar o volume até 1,5 ml com H2O estéril. Tubo B: 1,5 ml de 2x HBS (pré-aquecido até à temperatura ambiente). Pipetar a mistura no tubo A, até que uma solução homogénea. Adicione-se uma solução de solução B, gota a gota e deixar em repouso à temperatura ambiente durante 2-3 min. Aspirar meio de crescimento de células HEK293T e substituir por 22 ml de meio de HEK pré-aquecido, sem penicilina e estreptomicina. Pipeta combinado soluções AB (fosfato de cálcio precipitado) diretamente para HEK293T células e distribuir uniformemente pelo suave balanço. 24 horas após a transfecção de células HEK-293T células com lentivírus, remover meio de crescimento e substituí-la com 25 ml de fresco, médio HEK pré-aquecido. Retornar HEKS transfectadas para a incubadora. 48 h após a transfecção de células HEK-293T células com lentivírus, recolher o meio de crescimento contendo partículas lentivirais das HEKS transfectadas. Remover os restos em partículas a partir da solução viral colhidas por centrifugação a 3000 xg durante 5 min a 4 ° C. Concentrar vírus por ultracentrifugação through uma almofada de sacarose a 20% (2 ml sucrose/25 sobrenadante viral ml) durante 2 horas a 112.000 xg a 4 ° C. Suspender pellet viral em 0,4 ml MEF meio a 4 ° C durante 15-30 minutos com agitação suave. Armazenar as partículas virais em alíquotas de uso único (isto é, 50 ul) a -80 ° C. 2. Preparação de fibroblastos de rato embrionárias (MEF) para a reprogramação Nota: O protocolo apresentado aqui refere-se à derivação de iPSCs de E 13,5 fibroblastos de rato embrionárias para uso em ensaios de TEC. Enquanto outros grupos têm gerado todo-iPSC ratos de fontes de células adultas de doadores, nós não testei este método em outros tipos de células e não pode ter certeza de que tipo de célula doadora não é um fator. Configure acasalamentos rato cronometrados. No dia embrionário 13,5 (E13.5), eutanásia a mulher grávida e dissecar os embriões dos cornos uterinos. Lugar e embriões de loja em 1x PBS (pré-refrigerada a 4 ° C) em gelo. Remover os tecidos extra-embrionário (iecórion, âmnio e placenta). Decapitar o embrião e remova a cauda (opcional – se necessário para genotipagem) e membros. Retire os órgãos internos, utilizando fórceps ou uma espátula colher em forma e pique o restante da carcaça com a lâmina de uma tesoura ou bisturi afiado. Lava-se a carcaça de picada em 5 ml pré-refrigerada 1x PBS. Centrifugar a 200 xg durante 5 min. Aspirar o sobrenadante. Suspender o pellet em 5 ml de 0,25% de tripsina-EDTA e incubado a 37 ° C com agitação vigorosa durante 20-30 min. Adicionar 5 ml de meio de MEF (pré-aquecido a 37 ° C), misturar e centrifugar a 200 xg durante 5 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em pré-aquecido médio MEF. Placa MEFs dissociado em 2-3 cavidades de uma placa de 6 poços pré-revestidas com gelatina a 0,1%. Isto é considerado uma passagem. MEFs passagem a uma diluição de 1:04 – 01:05 hr cada 48. MEFs na passagem 3 está pronto para a transdução lentiviral. 3. Derivação das linhas iPSC Um dia antes de transdução lentiviral; semente ~ 3 x 10 5 MEFs primário para um poço de uma placa de 6 poços pré-revestidas com gelatina a 0,1%. Dia 1: Primário MEFs deve ser de 80-90% confluentes para a transdução lentiviral. Adicionar lentivirais partículas directamente para MEF media e incubar com MEFs a noite a 37 ° C, 5% de CO 2 num ambiente humidificado. No dia seguinte (dia 2) aspirar o meio e lava-se duas vezes com 3 ml de 1x PBS para remover as partículas virais. Adicionar 0,5 ml pré-aquecida de 0,25% de tripsina-EDTA para as células e incubar a 37 ° C durante 3-5 min com agitação ocasional. Tritura-se para obter uma suspensão de célula única. Observar as células por microscopia de luz para garantir uma suspensão de célula única. Transferência MEFs para um tubo cónico de 15 ml contendo 5 ml de meio MEF. Centrifugar a 200 xg durante 5 min. Aspirar o sobrenadante as células e ressuspender em meio levemente MEF. Divididos igualmente a suspensão de células entre dois poços de uma p 6 bemfinal pré-revestidas com gelatina a 0,1%. Agitar a placa para trás e para frente, de lado a lado, e uma vez com um movimento circular para alcançar uma distribuição uniforme de células ao longo do poço. Incubar durante a noite a 37 ° C, 5% de CO 2 num ambiente humidificado. Dia 3: Repita os passos 4-9, excepto dividir as células uniformemente a partir de um poço de 3 poços de uma placa de 6 bem pré-revestidas com gelatina a 0,1%. O resultado será de 6 poços transduzidos fibroblastos primários. Dia 4: Adicionar doxiciclina (dox), a uma concentração de 10 ug / ml a 5/6 poços. Um poço deve permanecer sem tratamento para servir de controlo. Adicionar VPA, 1,9 mM para 3 dos 5 poços tratados com dox. VPA reduz a taxa de proliferação de MEFs. Culturas densas de MEFs tolerar a exposição prolongada ao VPA enquanto que as culturas tendem a subconfluência senesce dentro de 2-5 dias. Por conseguinte, deve ser MEFs confluente de 100% quando o VPA é adicionado. Nota: Usamos VPA nas nossas experiências de reprogramação, porque é um modificador epigenética conhecida, e tem sido shprópria para aumentar a eficiência da geração iPSC 17, embora os efeitos e os mecanismos de acção de VPA com respeito à geração de linhas iPSC totalmente pluripotentes não são conhecidos. Dia 5: Aspirar o meio, lave e Tripsinizar as células como antes. Passagem das células tratadas com dox / VPA a uma placa de cultura de 15 centímetros 2 tecido pré-revestido com gelatina a 0,1% e cada uma das outras condições de pré-revestidas com 10 cm 2 em meio de pratos de células ES suplementadas com dox fresco e VPA. Repor células a cada dia com ESC meio suplementado com dox fresco e VPA. ESC-como colónias devem começar a aparecer após ~ 7 dias no tratamento dox / VPA e ~ 10 dias após o tratamento em dox sozinho. Sem colónias devem aparecer na ausência de tratamento dox. Uma vez que as colónias possuir uma refracção brilhante, borda bem definido e contém 30-50 células, manualmente isolar as colónias com uma ponta de pipeta de gel de carregamento e transferência para um fundo em U placa de 96 poços contendo 20 ul de 00,25% de tripsina-EDTA. Tripsinizar as células individuais e transferir para alimentadores de uma placa plana 96 poços de fundo em 150 ul de meio contendo ESC dox / VPA ou dox sozinho. Continuar a expandir as linhas clonalmente isoladas iPSC nos alimentadores em meio ESC. Remover dox VPA e no dia 19, após a sua adição (pós-transdução no dia 23). Descarte linhas iPSC que não mantêm auto-renovação ou taxa de proliferação semelhantes aos controles ESC. Pode ser útil para caracterizar suas linhas iPSC em relação a CES antes de tentar executar TEC. Temos caracterizado nossas linhas por 1) expressão de marcadores de pluripotência endógenos (SSEA-1, Oct4, Sox2, Nanog) por imunocitoquímica, 2) a análise do cariótipo por contagem de cromossomos e 3) formação de corpo embryoid. Pode-se também realizar lentiviral específica de RT-qPCR para confirmar que os transgenes provirais não são expressos nos iPSCs. No entanto, identificamos iPSCs totalmente pluripotentes usando apenas morfologia imunomarcação, e karyotyping. Nas nossas experiências, a selecção das linhas de base iPSC ESC-como morfologia e características de crescimento resulta em que a maioria das linhas que expressam marcadores de pluripotência enquanto que tipicamente identificar várias linhas de cariótipo potencialmente anormais. 4. Preparação de iPSCs para injeção Blastocisto Número de passagens de uma linha de PSC tem sido demonstrado que afecta a sua pluripotencialidade 18, embora isto possa ser a linha 19 dependente. Temos usado iPSCs de passagens a partir de 8-14 para a produção de adultos de todos os iPSC ratos. IPSCs descongelamento e placa em alimentadores em meio ESC. Passagem das células pelo menos uma vez nos alimentadores antes da utilização de injeção. Um poço de uma placa de 6 poços contendo 70-80% confluentes iPSCs irá fornecer mais do que um número suficiente de células para a injecção. Aspirar meio de crescimento e de lavar as células com ~ 3 ml de PBS 1x (sem + / ​​Mg 2 + Ca 2). Adicionar 0,5 ml pré-aquecida de 0,05% de tripsina-EDTA paraas células e incubar a 37 ° C durante 10 minutos com agitação ocasional. Tritura-se para obter uma suspensão de célula única. Observar as células por microscopia de luz para garantir uma suspensão de célula única. Os iPSCs precisam de estar em suspensão de célula única como colónias / agregados de células vão entupir a pipeta de injecção. Uma vez que uma única suspensão celular obtida foi ben, adicionar 1,0 ml ESC meios para o bem e devolver a placa à incubadora a 37 ° C. Incubar durante ~ 15 min, ou até a maior parte dos alimentadores de ter começado a aderir. Remover suavemente o meio contendo as iPSCs tendo cuidado para não deslocar os alimentadores fracamente aderentes. Coloque as iPSCs num tubo cónico de 15 ml contendo 5 ml de meio de ESC. Centrifugar a 200 xg durante 5 min. Aspirar o sobrenadante e remover o restante meio de células ES com uma micropipeta. Toque no tubo para retirar o sedimento de células e ressuspender em 0,2-0,5 suavemente meio FHM ml pré-arrefecida. Loja de células no gelo e até durante a injecção tetraplóide blastocysts. 5. Geração de blastocistos tetraploides Os procedimentos realizados nesta secção foram descritas em detalhe noutro local 5,6,20. Aqui destacamos a nossa técnica, otimizada para o celular Manipulator BTX Electro ECM 2001. Configure camundongos doadores de embrião por priming 23-28 dias de idade camundongos fêmeas (C57BL/6J-Tyr c-2J / BALB / cByJ F1) com TPM e HCG. Administrar 5 UI de PMS em 14:00 e 5 UI de HCG 47 horas mais tarde. Após a injeção de HCG, criado camundongos fêmeas com C57BL/6J-Tyr c-2J / BALB / cByJ acasaladas F1. Verifique o dia seguinte para plugues vaginais. Euthanize conectado camundongos fêmeas e recolher ovidutos. Colete 1 de células de embriões oviductos colocando em FHM com hialuronidase e gentilmente rasgar a ampulae. Permitir que as massas cumulus de se sentar em FHM / Hialuronidase para 5-7 min. Colete 1 de células de embriões utilizando uma pipeta de boca e lavar através de gotas de mídia FHM antes de colocá-los em KSOMCultura-AA. Cultura a 37 ° C, CO2 a 5% em óleo mineral durante a noite e seleccione 2 células de embriões no dia de electrofusão, eliminar todos os embriões outros. Coloque um MICROSLIDE BTX em uma placa de 10 cm de Petri. Despeje espaço suficiente mídia eletrofusão temperatura para submergir a lâmina na solução, mas não tanto que os pólos do eletrodo são completamente submerso. Ligue ECM 2001 e Enhancer BTX 400. Conectar cabos a ECM para o eléctrodo MICROSLIDE e fixar os cabos para o lado da placa de Petri para impedir o movimento não intencional do slide. Executar um pulso manual para obter uma leitura sobre o potenciador BTX e observe a tensão das correntes AC / DC a ser aplicadas. Corrente AC irá controlar a velocidade a que os embriões se alinhar entre os eléctrodos, a corrente CC irá fundir os blastómeros, e tempo de pulso irá definir o comprimento do impulso de DC. Um bom ponto de partida é o AC 3V, CC 100V, e tempo de 0,05 ms. A DC óptima varia na gama de 90-150 volts. </li> Usando uma pipeta, tomar cerca de 30-40 duas células de embriões de KSOM-AA cultura e lavá-los através de algumas gotas de meio de eletrofusão. Desenhe mídia eletrofusão frescos do prato MICROSLIDE em pipeta e tomar embriões a partir da lavagem. Colocá-los no intervalo de 1 mm entre os eletrodos sobre a MICROSLIDE. Ter o cuidado de que estão alinhados no meio da fenda e que eles não estão em contacto uns com os outros. Aplicar AC atual pressionando o botão de pulso manual. Os embriões rodará no campo AC, até que o plano de contacto blastômero é paralela aos eléctrodos. Se os embriões não estão alinhados em poucos segundos, aumente a configuração de CA. Depois de ter alinhado embriões, pressione o botão de pulso manual novamente para aplicar o pulso DC. Com meio eletrofusão na pipeta, recolher os embriões do MICROSLIDE. Lavar os embriões através de várias gotas de KSOM-AA e colocá-los em KSOM-AA cultura a 37 ° C CO, 5% 2. O blastômero fusão should ser completado em menos de 30 min em cultura. Repita os passos 7-11 para permanecer duas células de embriões. Após os grupos de fusão subseqüentes, monitorar e selecionar embriões com blastômeros fundidos. Embriões fundidas com sucesso irão parecer ser de uma célula de fase. Descartar embriões lisadas e 2-célula após 30 min em cultura. Se a taxa de fusão é inferior a 80%, o aumento de tensão e / ou de tempo, em incrementos de 5 V e 0,01 mseg. Se a lise for superior a 20%, diminuir a tensão de CC e / ou de tempo em conformidade. Os melhores ajustes em nossos experimentos foram AC 4V, DC 146V, e 0,07 ms. Estas definições consistentemente produziu taxas de 90% ou mais elevadas de fusão com pouca ou nenhuma lise. Continuar a cultura de embriões fundidos em microgotas de KSOM-AA em óleo mineral a 37 ° C, 5% CO 2. Deve esperar 85-95% de embriões fundidos para formar tetraplóides (4n) blastocistos após 48 h de incubação. 6. Microinjeção de iPSCs em blastocistos tetraploides Nós usamos uma Nikon TE-2000Umicroscópio invertido equipado com óptica de DIC e micromanipuladores Narishige para injecção de blastocistos. Cada blastocistos tetraplóides é injectado com 10-12 iPSCs utilizando um protocolo padrão para injecção ESC em blastocistos de ratinho que tem sido demonstrada em uma publicação anterior JoVE 5,20,21 Colocar uma gota de 20 ul de FHM no centro de uma lâmina de microscópio côncava e cobri-lo com 150 uL de óleo mineral. Abaixe a pipeta holding e agulha microinjeção na gota FHM. 2-3 min para permitir que ambas as agulhas para encher parcialmente com FHM. Lavar 20-30 blastocistos tetraplóides através gotas de FHM e transferência para a queda FHM na lâmina de microscópio. Boca pipeta mistura iPSC na gota. Pode ser necessário diluir a mistura de células numa gota de FHM antecipadamente se as células são muito concentradas, ou agregados. Pegue 100-200 células com a agulha de injeção. Segurar o blastocisto com a massa celular interna no posit horas 9íon. Injectar células em blastocélica penetrando a zona pelúcida e trofoblasto na posição de 3 horas. Injectar 16-18 células por blastocisto. Retornar iPSC blastocistos complementadas para KSOM-AA cultura. 7. Transferência de complementada Blastocistos tetraploides nos cornos uterinos de camundongos destinatário Complementadas blastocistos tetraplóides são cirurgicamente transferidos para os cornos uterinos de camundongos fêmeas receptoras de acordo com as diretrizes do instituto do pesquisador, utilizando a técnica padrão de 20 que vamos resumir. Selecione femininos ratinhos CD-1 na fase pró-estro e configurá-los para o acasalamento com machos vasectomizados. Verifique para plugues vaginais na manhã seguinte. As fêmeas estão prontas para a transferência de embriões uterinos, dois dias após o bujão foi detectada (2,5 dpc). Um dia antes de fêmeas receptoras são acasaladas com machos vasectomizados, configurar adicionais CD-1 fêmeas com machos vasectomizados nãopara ser usado como mães adotivas para todo-iPSC ratos recuperados por cesariana. 8. Cesariana e Fomento da iPSC derivados Pups A transferência de embriões TC normalmente resulta em múltiplas reabsorções após o implante, mesmo se o iPSC ou ESC linha tem um alto potencial de desenvolvimento. Como resultado, pode-se esperar que não mais de 4 crias viáveis ​​(geralmente 1-2) por recipiente. Estas ninhadas pequenas são normalmente negligenciados pelos destinatários. Para aumentar o nível de cuidado neonatal ea taxa de sobrevivência, nós realizar cesarianas e fomento de acordo com os protocolos padrão de 20. Para realizar a cesariana, eutanásia ratos receptores 16 dias após a transferência de embriões em 7 20:00 (destinatário 18,5 dpc) e dissecar os filhotes dos cornos uterinos. Promover filhotes viáveis ​​para um CD-mães que ninhadas entregues no mesmo dia.