Biz intrasellüler serbest kalsiyum konsantrasyonu ve sinaptik etkinliği değişiklikleri eşzamanlı bir ganglion hazırlanmasında nasıl takip edilebileceğini göstermektedir<em> Aplysia'nın</em>. Biz görüntü intraselüler kalsiyum floresan boya, Kalsiyum Turuncu ve keskin (hücre içi) elektrotlar ile sinaptik iletim teşvik ve izlemek kullanarak.
Bu, hücre içi kalsiyumda değişiklikler sinaptik plastisite (örn., homosynaptic kolaylaştırma 1) arasında önemli formları bir dizi indüksiyon aracılık öne sürülmüştür. Bu hipotezler eşzamanlı intraselüler kalsiyum değişiklikleri ve sinaptik etkinliği değişiklikler izlenerek test edilebilir. Bu hücre içi kayıt tekniği ile kalsiyum görüntüleme birleştirerek gerçekleştirilebilir gösterilmektedir. Bizim deneyler yumuşakça Aplysia'nın californica bir bukkal ganglion yapılmaktadır. Bu hazırlık deneysel avantajlı bir dizi özellik vardır: Gangliyon kolayca Aplysia'nın kaldırılır ve deneyler, normal sinaptik bağlantıları yapmak ve normal bir iyon kanal dağıtım olan yetişkin nöron kullanmak olabilir. Aplysia için doğal hayvan düşük metabolik oranı ve nispeten düşük sıcaklıklarda (14-16 ° C) bağlı olarak, müstahzarlar uzun süreler boyunca stabildir.
Bu uzun dalga boyu floresan boya kalsiyum bağlandığı zaman biz kolayca iyontoforez yoluyla nöron içine 'yüklü' olduğunu Kalsiyum Turuncu 2 hücre geçirgenliği olmayan sürümünü kullanacaktır intrasellüler serbest kalsiyum değişiklikleri. saptamak için ent ">, floresan yoğunluğu artar. Kalsiyum Turuncu var hızlı kinetik özellikleri 3 ve rasyometrik boyalar aksine (örneğin, Fura 2), görüntüleme için herhangi bir filtre tekerleği gerektirir. Kararlı ve diğer boyalar (örneğin, flüoresan 3) 2,4 daha az fototoksik oldukça fotoğrafı. olmayan tüm rasyometrik gibi Bu yükleme ve difüzyon nedeniyle boya konsantrasyon değişiklikleri hesaba katmak için mümkün değildir, çünkü boyalar, kalsiyum Orange, kalsiyum konsantrasyonu olarak göreceli değişiklikleri gösterir. Ancak, bu mutlak bir kalsiyum konsantrasyonu sağlayacak şekilde kalibre edilebilir değildir.Bir dik, sabit sahne, bileşik mikroskop saniyede 30 kare etrafında kayıt yapabilen bir CCD kamera ile görüntü nöronlar için kullanılmıştır. Aplysia'nın Bu zamansal çözünürlükteHücre içi kalsiyum konsantrasyonunda dahi, tek bir sivri uç oluşturulan değişiklik tespit etmek için yeterli olacaktır. Keskin elektrotlar aynı anda tespit pre-ve postsinaptik nöronların sinaptik indüklemek ve kaydetmek için kullanılır. Her denemenin sonunda, özel bir komut dosyası elektrofizyoloji ve görüntüleme verileri birleştirir. Doğru senkronizasyon sağlamak için biz mikroskop kamera bağlantı noktasına monte edilmiş bir LED bir ışık nabız kullanın. Presinaptik kalsiyum düzeyleri (intrasellüler EGTA enjeksiyon yoluyla örneğin) Manipülasyonu bize plastisite çeşitli şekillerde arabuluculuk intraselüler kalsiyum rolüne ilişkin spesifik hipotezleri test etmeye imkan vermektedir.
Bu aynı anda hücre için kalsiyum konsantrasyonunun izlemek ve sinaptik etkinliğinin değerlendirilmesi için de kullanılabilir yöntemleri göstermektedir. Bu teknikler, kısa süreli plastiklik çeşitli şekillerde nasıl yönlendirildiğini belirlenmesi bakımından yararlıdır.
Görüntüleme floresan mikroskop ve CCD kamera ile yürütülmektedir. En fonksiyonel görüntüleme set-up ile karşılaştırıldığında bu ekipman gereksinimleri nispeten mütevazı. Tekniği basit ve …
The authors have nothing to disclose.
A PHS Grant (MH51393) bu çalışmalarını desteklemiştir. Kullandığımız Aplysia'nın Bazı Araştırma Kaynakları, NIH National Center for Grant RR10294 altında Miami Üniversitesi Aplysia'nın için Ulusal Kaynak tarafından sağlanmaktadır.
Reagent Name | Company | Catalogue Number | Comment |
Calcium Orange | Invitrogen | C-3013 | |
EGTA | Sigma | E-4378 | |
Calcium calibration buffer kit | Invitrogen | C-3008MP | useful for testing the sensitivity and dynamic range of the signal |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | M0250 | used in 0.33 M solution to anesthetize animal |
Table 1. Reagents used.
Equipment Name | Company | Comment |
FN-1 upright fluorescence microscope | Nikon Instruments | with Narishige ITS-FN1 stage |
NMN-21 manipulators | Narishige | mounted on stage with magnets |
CoolSNAP HQ2 CCD camera | Photometrics | |
NIS elements AR (version 3.22) |
Nikon Instruments | imaging software used to acquire fluorescence data |
10X/0.3w Plan Fluor objective | Nikon Instruments | this water immersion lens has a very long working distance of 3.5 mm |
X-Cite 120 PC metal halide lamp | EXFO | used for fluorescence imaging |
LS-DWL halogen lamp |
Sumica | |
ET-CY3 filter set | Chroma Technology | |
Power 1401 A/D converter | Cambridge Electronic Design | sampling was done at 3 kHz |
Spike II (version 7.07) |
Cambridge Electronic Design | software used to acquire electrophysiology data |
SEC-10 LX amplifier | NPI electronics | used with a 10X headstage |
Model 410 amplifier | Brownlee precision | used to amplify and filter the signal |
WS-4 | minus k Technology | vibration isolation for imaging |
cooling platform | custom made | brass plate through which ice water is pumped at a variable rate |
Table 2. Equipment used.