우리는 세포 내 무료 칼슘 농도와 신경 효능의 변화가 동시에의 신경절 준비에 모니터링 할 수있는 방법을 보여줍니다<em> Aplysia</em>. 우리는 이미지 세포 내 칼슘을 형광 염료, 칼슘 오렌지, 그리고 날카로운 (세포) 전극과 신경 전달을 유도하고 모니터링을 사용합니다.
Abstract
그것은 세포 내 칼슘의 변화는 시냅스 소성 (예를 들어, homosynaptic 촉진) 1의 중요한 형태의 수의 유도를 중재하는 것이 좋습니다되었습니다. 이 가설이 동시에 세포 내 칼슘의 변화와 신경 효능에 변경을 모니터링하여 테스트 할 수 있습니다. 우리가이 세포 내 기록 기술을 칼슘 이미징를 조합하여 수행 할 수있는 방법을 보여줍니다. 우리 실험은 연체 동물 Aplysia californica의 구강 신경절로 진행됩니다. 이 준비가 실험적으로 유리한 특징을 가지고 : 신경절 쉽게 Aplysia에서 제거 실험 일반 시냅스 연결을 확인하고 정상 이온 채널 유통이 성인 뉴런을 사용 할 수 있습니다. Aplysia에 대한 자연 동물의 낮은 신진 대사 속도와 상대적으로 낮은 온도 (14-16 ° C)로 인해 준비는 오랜 기간 동안 안정적입니다.
이 긴 파장 형광 염료는 칼슘에 바인딩 할 때 우리가 쉽게 iontophoresis를 통해 신경 세포로 '로드'이다 칼슘 오렌지 2의 셀 impermeant 버전을 사용합니다 세포 무료로 칼슘의 변화를. 감지 할 다닐 ">, 형광 강도가 증가. 칼슘 오렌지가 빠른 운동 특성 3는 ratiometric 염료와는 달리 (예를 들어, Fura 2), 영상에 대한 필터 휠을 필요하지 않습니다. 그것은 안정적이고 다른 염료 (예를 들어, fluo-3) 2,4 이하 phototoxic 상당히 사진입니다. 모든 비 ratiometric처럼 이 로딩 및 확산으로 인한 염료 농도의 변화에 대한 계정 수 없기 때문에 염료는 칼슘 오렌지, 칼슘 농도의 상대적인 변화를 나타냅니다. 그러나, 그것은 절대 칼슘 농도를 제공하기 위해 보정 할 수 없습니다.
수직, 고정 무대, 복합 현미경은 초당 30 프레임 주위에 녹화 할 수있는 CCD 카메라로 이미지 뉴런에 사용되었습니다. Aplysia이 시간적 해상도에서세포 내 칼슘 농도에서도 하나의 스파이크 유도 변경을 감지하기에 충분한 이상이다. 샤프 전극을 동시에 식별 사전 및 postsynaptic 뉴런에서 신경 전달을 유도하고 기록하는 데 사용됩니다. 각 시험의 결론에서, 사용자 정의 스크립트가 전기 생리학 및 이미징 데이터를 결합합니다. 적절한 동기화를 보장하기 위해 우리는 현미경의 카메라 포트에 장착 LED에서 빛 펄스를 사용합니다. presynaptic 칼슘 레벨 (세포 EGTA 주입을 통해 예를 들어)의 조작은 우리가 소성의 다양한 형태의 중재에 세포 내 칼슘의 역할에 관한 구체적인 가설을 테스트 할 수 있습니다.
Protocol
1. 준비하기 75-100 ML 등장 염화 마그네슘 용액을 주입하여 동물을 마취. 우리는 이미지에 사용 Aplysia은 일반적으로 150-200그램하고 Marinus 과학에서 얻을 수 있습니다. 왁스 대상 접시에 anesthetized 동물을 핀. 주사기 바늘은이 목적을 위해 잘 작동, 멸균 기술은 필요하지 않습니다. 총 포셉 및 표준 가위를 사용하면 동물의 발에 절개를하고 구강 질량을 쉽게받을 수 있습니다. 구?…
Discussion
우리는 동시에 세포 내 칼슘 농도를 모니터링하고 신경 전달의 효능을 평가하는 데 사용할 수있는 기술을 보여줍니다. 이 기술은 단기 소성의 다양한 형태가 중재하는 방법을 결정하는 데 유용합니다.
영상은 형광 현미경과 CCD 카메라로 수행됩니다. 대부분의 기능 이미징 세트 업에 비해이 장비 요구 사항은 상대적으로 겸손입니다. 기술은 간단하고 배우기 쉽다. CCD 카메라?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PHS 기금 (MH51393)는이 일을 지원합니다. 우리가 사용하는 Aplysia의 일부는 연구 자료, NIH의 국립 센터에서 부여 RR10294 아래의 마이애미 대학의 Aplysia을위한 국가 자원에 의해 제공됩니다.
Materials
Reagent Name
Company
Catalogue Number
Comment
Calcium Orange
Invitrogen
C-3013
EGTA
Sigma
E-4378
Calcium calibration buffer kit
Invitrogen
C-3008MP
useful for testing the sensitivity and dynamic range of the signal
Magnesium chloride hexahydrate
Sigma
M0250
used in 0.33 M solution to anesthetize animal
Table 1. Reagents used.
Equipment Name
Company
Comment
FN-1 upright fluorescence microscope
Nikon Instruments
with Narishige ITS-FN1 stage
NMN-21 manipulators
Narishige
mounted on stage with magnets
CoolSNAP HQ2 CCD camera
Photometrics
NIS elements AR
(version 3.22)
Nikon Instruments
imaging software used to acquire fluorescence data
10X/0.3w Plan Fluor objective
Nikon Instruments
this water immersion lens has a very long working distance of 3.5 mm
X-Cite 120 PC metal halide lamp
EXFO
used for fluorescence imaging
LS-DWL
halogen lamp
Sumica
ET-CY3 filter set
Chroma Technology
Power 1401 A/D converter
Cambridge Electronic Design
sampling was done at 3 kHz
Spike II
(version 7.07)
Cambridge Electronic Design
software used to acquire electrophysiology data
SEC-10 LX amplifier
NPI electronics
used with a 10X headstage
Model 410 amplifier
Brownlee precision
used to amplify and filter the signal
WS-4
minus k Technology
vibration isolation for imaging
cooling platform
custom made
brass plate through which ice water is pumped at a variable rate
Ludwar, B. C., Evans, C. G., Cropper, E. C. Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia. J. Vis. Exp. (65), e3907, doi:10.3791/3907 (2012).