Immunohistological 감각 신경 세포의 Dendrites에 Microtubules의 라벨링, Tracheae, 그리고 근육에 Drosophila 유충 바디 벽
Summary
등의 연결을 dendrites 같은 복잡한 세포 모양은, 개발하는 동안 달성하는 방법 이해하기 위하여, 정확하게 분석 미세 소관 기관 수 있도록 중요합니다. 여기 돌기 arborization의 신경 감각 dendrites의 미세 소관 조직, 기관, 근육을 검토하는 강력한 immunohistological 라벨링 방법을 설명 및 기타<em> Drosophila</em> 유충 바디 벽 조직.
Abstract
복잡한 세포 형태의 차이가 달성되는 방법을 이해하기 위하여, 정확하게 미세 소관 조직을 수행하는 것이 중요합니다. Drosophila 애벌레 바디 벽이 세포와 조직 morphogenesis을 연구하는 모델 몇 가지 세포 유형이 포함되어 있습니다. 예를 들어 tracheae는 튜브 morphogenesis 1, Drosophila의 유충의 감각 뉴런은 일반의 해설과 모수 석의 차별화 2-5와 퇴보 6 신경 세포 수준의 특정 메커니즘에 대한 기본 시스템이되고있는 돌기 arborization (DA)를 검사하는 데 사용됩니다 .
dendrite 가지의 모양은 신경 세포 클래스 사이에 크게 다릅니다, 심지어는 하나의 신경 세포 7,8의 다른 지점 사이에 있습니다. DA의 뉴런의 유전자 연구는 차동 cytoskeletal 조직이 돌기 지점 모양 4,9-11의 형태학의 차이를 기초 수있는 것이 좋습니다. 우리에게 강력한 면역 라벨 방법을 제공DA 감각 신경 dendrite 아버의 생체내의 미세 소관 기관 (그림 1, 2, 영화 1) ssay. 이 프로토콜은 먼저 instar의 유충의 해부와 immunostaining, 활성 감각 신경 세포의 dendrite의 파생물 및 분기 조직 12,13을 발생하는 단계를 보여줍니다.
감각 뉴런을 얼룩뿐만 아니라,이 방법은 강력한 근육의 미세 소관 조직의 라벨 (영화 2, 3),기도 (그림 3, 영화 3), 기타 신체 벽의 조직을 실현하고 있습니다. 그런 메커니즘을 조사하면 신체 벽에 현장에서 미세 소관 조직을 분석하고자 조사에 대한 가치가 컨트롤 조직 및 세포 모양.
Protocol
1. 시약의 준비 시작하기 전에주의 사항 : 해부 및 immunohistochemical 얼룩은 자기 챔버에서 수행되고 유충은 특별히 모양의 곤충 핀을 사용하여 넘어뜨린 것입니다. 자기 챔버 건설, 이들 핀의 준비에 대한 자세한 지침은 관련 참고 문헌 14,15에서 찾을 수 있습니다. 간단히, 1x1cm의 사각형 구멍은 자성 시트 및 소형 챔버를 만들기 위해 시트의 뒤쪽에 부착된 cove…
Discussion
그것을 달성하는 방법 복잡한 세포 모양 이해하기 위해서는 정확하게 분석 미세 소관 기관 수 있도록 중요합니다. 여기 돌기 arborization의 신경 감각 dendrites의 분석 미세 소관 기관에 대한 강력한 immunohistological 라벨링 방법을 설명합니다. 얼룩 감각 신경뿐만 아니라,이 방법은 기관, 근육 및 다른 신체 벽면 조직의 강력한 immunohistological 얼룩을 구현합니다.
우리는 DA의 뉴런의 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 자금에 대한 RIKEN 주셔서 감사합니다. P10 – Gal4은 알랭 빈센트 (Université 폴 Sabatier, 툴루즈, 프랑스)의 일종 선물했다.
Materials
| Name of the reagent | Company |
Catalogue number |
Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Forceps | Dumont | 11251-20 | |
| Microscissors | FST | 15000-08 | |
| Mouse anti-α-tubulin (Clone: DM1A) | Sigma | T9026 | Dilution 1/1000 |
| Mouse anti-Futsch (Clone: 22C10), supernatant |
Developmental Studies Hybridoma Bank |
22C10 | Dilution 1/1000 |
| Rat anti-CD8 (Clone: 5H10) | Caltag | MCD0800 | Dilution 1/1000 |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse IgG | Invitrogen | A-11001 | Dilution 1/500 |
| Cy3 anti-Rat IgG | Jackson Immunoresearch | 712-166-150 | Dilution 1/200 |
References
- Schottenfeld, J., Song, Y., Ghabrial, A. S. Tube continued: morphogenesis of the Drosophila tracheal system. Curr. Opin. Cell. Biol. 22, 633-639 (2010).
- Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila. Genes Dev. 13, 2549-2561 (1999).
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136, 1049-1061 (2009).
- Moore, A. W. Intrinsic mechanisms to define neuron class-specific dendrite arbor morphology. Cell. Adh. Migr. 2, 81-82 (2008).
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129, 2867-2878 (2002).
- Nishimura, Y. Selection of Behaviors and Segmental Coordination During Larval Locomotion Is Disrupted by Nuclear Polyglutamine Inclusions in a New Drosophila Huntington’s Disease-Like Model. J. Neurogenet. 24, 194-206 (2010).
- Ramon y Cajal, S. . Histology of the nervous system of man and vertebrates, 1995 translation. , (1911).
- London, M., Hausser, M. Dendritic computation. Annu. Rev. Neurosci. 28, 503-532 (2005).
- Jinushi-Nakao, S. Knot/Collier and cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape. Neuron. 56, 963-978 (2007).
- Li, W., Gao, F. B. Actin filament-stabilizing protein tropomyosin regulates the size of dendritic fields. J. Neurosci. 23, 6171-6175 (2003).
- Ye, B. Differential regulation of dendritic and axonal development by the novel Kruppel-like factor Dar1. J. Neurosci. 31, 3309-3319 (2011).
- Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in drosophila sensory neurons. Neuron. 63, 788-802 (2009).
- Sugimura, K. Distinct developmental modes and lesion-induced reactions of dendrites of two classes of Drosophila sensory neurons. J. Neurosci. 23, 3752-3760 (2003).
- Budnik, V., Gorczyca, M., Prokop, A. Selected methods for the anatomical study of Drosophila embryonic and larval neuromuscular junctions. Int. Rev. Neurobiol. 75, 323-365 (2006).
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. . Drosophila Protocols. , (2000).
- Shimono, K. Multidendritic sensory neurons in the adult Drosophila abdomen: origins, dendritic morphology, and segment- and age-dependent programmed cell death. Neural. Dev. 4, 37-37 (2009).
- Colomb, S., Joly, W., Bonneaud, N., Maschat, F. A concerted action of Engrailed and Gooseberry-Neuro in neuroblast 6-4 is triggering the formation of embryonic posterior commissure bundles. PLoS One. 3, 2197-2197 (2008).
- Dubois, L. Collier transcription in a single Drosophila muscle lineage: the combinatorial control of muscle identity. Development. 134, 4347-4355 (2007).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18, 377-402 (2004).
- Hummel, T., Krukkert, K., Roos, J., Davis, G., Klambt, C. Drosophila Futsch/22C10 is a MAP1B-like protein required for dendritic and axonal development. Neuron. 26, 357-370 (2000).
- Zipursky, S. L., Venkatesh, T. R., Teplow, D. B., Benzer, S. Neuronal development in the Drosophila retina: monoclonal antibodies as molecular probes. Cell. 36, 15-26 (1984).
- Brent, J., Werner, K., McCabe, B. D. Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (25), e1108-e1108 (2009).
- Karim, M. R., Moore, A. W. Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics. J. Vis. Exp. (57), e3111-e3111 (2011).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila Larval NMJ Dissection. J. Vis. Exp. (24), e1107-e1107 (2009).
- Tao, J., Rolls, M. M. Dendrites have a rapid program of injury-induced degeneration that is molecularly distinct from developmental pruning. J. Neurosci. 31, 5398-5405 (2011).
- Yamamoto, M., Ueda, R., Takahashi, K., Saigo, K., Uemura, T. Control of axonal sprouting and dendrite branching by the Nrg-Ank complex at the neuron-glia interface. Curr. Biol. 16, 1678-1683 (2006).
- Mattie, F. J. Directed microtubule growth, +TIPs, and kinesin-2 are required for uniform microtubule polarity in dendrites. Curr. Biol. 20, 2169-2177 (2010).
- Pawson, C., Eaton, B. A., Davis, G. W. Formin-dependent synaptic growth: evidence that Dlar signals via Diaphanous to modulate synaptic actin and dynamic pioneer microtubules. J. Neurosci. 28, 11111-11123 (2008).
- Williams, D. W., Tyrer, M., Shepherd, D. Tau and tau reporters disrupt central projections of sensory neurons in Drosophila. J. Comp. Neurol. 428, 630-640 (2000).
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Yalgin, C., Karim, M. R., Moore, A. W. Immunohistological Labeling of Microtubules in Sensory Neuron Dendrites, Tracheae, and Muscles in the Drosophila Larva Body Wall. J. Vis. Exp. (57), e3662, doi:10.3791/3662 (2011).