1. Kraniektomi Bir ameliyat sırasında steril cerrahi site izofluran sürekli inhalasyon için izin O 2 floş (Parkland Bilimsel) ile anestezi makinesine bağlı bir fare gaz anestezi kafa tutucu (Kopf Araçlar) fareler için stereotaksik hizalama aracı (Kopf Araçlar) de dahil olmak üzere hazırlanmıştır. . C ameliyat sırasında farenin altına yerleştirilmiş ° ısıtıcı 37 tuttu. Cerrahi mikroskop ve ışık kaynağına ihtiyaç vardır. Deneyci kapsayan bir laboratuvar önlüğü, cerrahi maske, ayak kapsayan, eldiven ve kafa giymeli. Cerrahi alan irtibata tüm alet ve malzemelerin sterilize edilmelidir. Bir Luer-lok kadın sonunda oluşan bir yaralanma merkezi, bir jilet ile ½ "iğne (Becton Dickinson). Hub hafif bir önyargı ile kesilmiş ve olmalıdır, 20 g 1 metal uç keserek oluşturulur yaklaşık 3 mm iç çapı açılışı var. trefin (1,10 adım) doğru çaplı bir yaralanma merkezi ölçmek ve imal etmek için kullanılan olabilir. Hub Bir hub hayvan başına gereklidir. kafatasına bağlı ve LFP bağlı olacak nabız basıncı sağlamak için bir cihaz. Katı naylon kord (1.7 mm çapında, örneğin ot düzeltici çizgi) bir jilet kullanarak ~ 1 mm kalınlığında diskler halinde kesilir. Yine, hayvan başına tek bir disk gereklidir. Bu, (bkz. adım 1.10) kraniektomi yaparken trefin stabilize etmek için kullanılır. Fareler herhangi bir gerginlik ve yaş (- 9 ay öncelikle C57BL / 6 yaşları 1) olabilir. Fare en az 1 dakika için küçük bir indüksiyon odası (% 4-5 izofluran% 100 O 2 ile önceden doldurulmuş) tartılır ve anestezi. Preemptif analjezi için, buprenorphrine bir enjeksiyon (0.1 mg / kg) intraperitoneal olarak verilir ve fareyi bir dakika için odasına geri yerleştirilir. Analjezik rejimi yerel hayvan kullanımı ve bakımı komitesi ile istişare ile teyit edilmelidir. Farenin başının üstüne saç mümkün olduğunca deriye yakın olarak kesilir. Fare stereotaksik hizalama enstrüman uçucu gaz anestezi (Kopf Araçlar) yönetmek için tasarlanmış ısırık kaplama ile donatılmış bir konuma sahiptir. Isofluran gaz seviyesi% 2 ya da etkisi azalır. Nefes alıp verme hızı ameliyat sırasında görsel olarak takip edilmektedir. Işlem sırasında uygun ekipman kullanarak kan gazları gibi diğer fizyolojik parametreleri (p O 2, CO 2 p), kan pH ya da kan basıncı ölçülebilir. Suni gözyaşları yağ göz merhemi, gözlerde kuruma onları tutmak için bir pamuk aplikatör kullanarak fare konur. Povidon-iyot,% 70 alkol ile izlenen bir pamuk aplikatör ile gözler ve boyun arasındaki cilde uygulanır. Povidon-iyot ve alkol uygulaması, toplam 3 kez tekrarlanır. Bir orta hat kesi saçlı deri, kafatası maruz ve net bir cerrahi alan sağlamak için küçük bir bulldog kelepçeler ile retrakte bir neşter (# 15 bıçak) ve deri (Güzel Bilim Araçları # 18.050-28) kullanarak gözleri boyun yapılır. Bulldog kelepçeler kafatasının lateral kenarları kapalı asmak. Topikal anestezik bupivakain (% 0.025 'i tuzlu su) bir pamuk aplikatör ve fasya diş aracı veya kemik kazıyıcı (örneğin, Güzel Bilim Araçları, # 10.075-16) ucu ile kafatası sıyrılarak kafatası uygulanır. Kalıcı bir belirteç yarım bregma ve lambda arasında ve sağ hemisfer (~ 2 mm orta hat, sağ) üzerinde sagital sütür ve yanal sırt arasında kafatası işaretlemek için kullanılır. Loctite siyanoakrilat yapıştırıcı (Loctite Tak Pak 454) Bir damla tekne ve yan grasperın (Güzel Bilim Araçlar, Dumont # 6) bir disk içine ot katı naylon kord (yukarıdaki 1.3 'e bakınız) daldırma için kullanılır ağırlığında plastik konur tutkal ve kafatası işareti disk tuşuna basın. Bir iki damla Loctite Hızlandırıcı tutkal sertleştirme neden bir 1ml şırınga ve 26 3 / 8 G iğne kullanarak disk üzerine teslim edilir. Devam etmeden önce kafatası disk testi bağlılık. Disk üzerinde 3 mm dış çaplı trefin (Araştırma Enstrümantasyon Dükkanı, University of Pennsylvania) yerleştirin ve kafatası kesti kadar saat yönünde döndürün. Trefin ilerleme çok uzak kafatası ve ihlal dura delik önlemek için sık sık kontrol edin. Hafifçe basıldığında kafatasının kafatası flap disk ve çevresinde incelme gevşek bir hissedeceksiniz olacaktır. Kafatasının altında gözetlemek ve kemik flep kaldırmak için diş aracı paralel / kafatası yüzeyinde yatay yerleştirin. Forseps ile kafatası kemik ayırın. Dura ödün vermeden küçük bir kanama miktarı, varsa, kanamayı durdurur ve dura üzerine elde kemik tozu önlemek kadar baskı uygulamak için bir pamuk aplikatör kullanın. Ancak herniasyonu gibi görünür dura ihlali varsa, hayvan insani ötenazi deneme elimine edilmelidir. Bu adım, yeterli pratik gerektirir.gerekli cerrahi beceri elde etmek için. Forseps kullanarak hub önyargı kafatası eğriliği (yani hub uzun kenarı kafatası yanal sırt yakınında yer almaktadır) ile uyumlu olduğunu, kafatası kraniektomi üzerinden pozisyonda yaralanma merkezi korumak. Bu arada, tahta bir sopa, sivri uçlu bir jilet ile bir açıyla kesilmiş kullanarak, elinin tersiyle hub dış kenarlarında süper yapıştırıcı jel uygulayın ve göbek deliği üzerinde dik yapıştırılmıştır kadar stabilize. Bakım dura üstüne tutkal almak için alınmalıdır. Tutkal üzerinde dura yaralanma zayıflamasına neden olacaktır. Küçük bir kağıt bardak kullanarak, viskoz bir çözüm oluşturmak için metil-metakrilat diş akrilik (Perm Reline / Onarım Reçine, Butler Schein Jet Akrilik Sıvı) karıştırın. Yaralanma merkezi etrafında çimento uygulamak için ekli herhangi bir iğne ile 1 cc şırınga kullanın. Çimento yaralanma hub alt 2 mm yanı sıra çevredeki maruz kafatası kapsamalıdır. Kafatası sütür yaralanma sıvı bolus kraniyal kavite içinde kalmasını sağlamak için çimento ile mühürlenir. Hub bir şırınga ve körletilmeye iğne kullanılarak steril% 0.9 NaCl (serum fizyolojik) ile doldurun. Salin kurtarma aşamasında dura nemli tutmak. Buna ek olarak, yaralanma merkezi dolu kalmaz eğer, kafatası hub bağlantısı bir sızıntı gösterecektir ve yeni bir hub eklenmelidir. Fare stereotaksik hizalama aracı kaldırılır ve bir ısınma plaka üzerinde herhangi bir tel çubuk kapaklı boş bir kafes yerleştirilir steril serum fizyolojik IP 0,25 ml enjeksiyon, verilmelidir. Kafesin alt tarafında bazı hydragel koyun ve fareler 1-2 saat kurtarmak için izin verir. 2. Yaralanma indüksiyonu LFP cihaza bağlı olan osiloskop (Tektronix TDS 1001B, İki Kanal Digi Depolama Osiloskop 40 MHz, 500Ms.s) ve amplifikatör (Travma indükleyicisi Basınç Transducer Amplifikatör) açın. LFP cihazı (Özel Tasarım ve Üretim, Virginia Commonwealth University) ve buna bağlı yüksek basınç boru (uzunluk 41cm, hacim 2ml, Baxter # 2C5643) steril su ile doldurulur ve hava kabarcıkları serbest olduğunu onaylayın. Boru sonunda bir erkek Luer-lok parça. Boru Luer-lok sonu kapalı, sarkaç serbest test bakliyat sunmak. Cihaz yaklaşık 10 test bakliyat sunarak astarlanmalıdır. Bu sarkaç osiloskop ve amplifikatör pürüzsüz sinyal verir onaylayın. Gürültülü bir sinyal sistemi yaralanma darbe teslim öncesinde sökülmelidir hava gösterir. Darbe süresi yaklaşık 20 milisaniye olmalıdır. LFP cihazı ile birlikte transdüser amplifikatör kalibre, 10 mV = 1,0 inç kare başına pound (PSI). Bir atmosfer (ATM) = 14.7 PSI. Refleks süreleri ve pulmoner ödem ile ilgili giderek artan bir ölüm doğrulan bir dizi üretmek için 2.1 atmosfer – 0.9 aralığında teslim Sakatlık baskıların genellikle. 4 dakika ve 0 -% 5 ölüm oranı Hafif yaralanma 2 düzeltilmesi refleks süresi olarak kabul edilmektedir. 10 dakika ve 10 -% 20 ölüm oranı Orta yaralanma 6 düzeltilmesi refleks süresi olarak kabul edilmektedir. Gerekirse, darbe yoğunluğunu artırmak veya azaltmak için sarkaç açısını ayarlayın. Sarkaç başlangıç pozisyonuna açı yaklaşık 10 derecedir. LFP cihazı ayarladıktan sonra, boru Luer-Lok ucunu açmak için emin olun. Fare anestezi cerrahi düzlemine ulaşana kadar% 4-5 izofluran anestezi odası (ön-ücret) yerleştirilir. Fare LFP cihazının yanında bir platform üzerine yerleştirilir ve hub steril tuzlu su ile doldurulur. Hub dişi Luer-lok uydurma bir erkek Luer-lok LFP cihazın tüp takılır. Hayvan yan ve bir kez normal solunum paterni devam eder yerleştirilen ancak tam bilinç (~ 2 dk) kazanmak için önce hayvan, LFP cihazın sarkaç yaralanma tek bir darbe neden yayınlandı. , Solunum yetmezliği ve ölüme neden olabilir hayvan çok anestezi ise hasara yol değil önemlidir. Darbe tam basınç kayıt altına alınmalıdır. Yaralanmamış bir şekilde hasara yol için gerçek bir sıvı darbe dışında, sahte hayvanlar ile aynı usullere tabi. Hayvan LFP cihaz hemen kaldırılır ve düzeltilmesi refleks zaman izlemek için sırtında yer olmalıdır. Fare kendini doğrultarak sonra, tekrar ardından kısa bir süre anestezi ve çimento ve göbek elle kafatası bir araya kaldırıldı. Kafa derisi sonra Vetbond doku yapıştırıcısı (3M), dikiş ya da zımba ile kapatılır. Herhangi bir hub dura veya oklüzyonu herniasyonu olduğunu kaydetti. Tıkalı bir hub bilinmeyen büyüklükte bir zayıflatılmış yaralanma üretecektir. Sonra ayaktan ve ev kafes döndü kadar hayvan bir ısınma pad üzerinde kafes yerleştirilir. 3. Değerlendirme, motor, bilişsel ve histolojik sonuçlar MoLFP neden tor açıkları rotarod testi, entegre vestibulomotor ve sensorimotor fonksiyon 21 bir gösterge kullanılarak tespit edilebilir. Bütün hayvanlar bir temel okuma belirlemek ve paradigma farelerin gelmesini yaralanma önce test edilmelidir. Fareler yaralanma öncesinde iki gün boyunca 1 saat intertrial aralıklarla günde 3 kere rotarod cihaz eğitilmiştir. Lastik bir yüzeye sahip bir 36 mm dış çapı, döner çubuk, dengelemek için gecikme ölçülür. Hızı 4-40 rpm 180 sn aralığında artar. Hayvan rotarod düştüğünde her deneme sona erer. Hasarı (genellikle 1, 7 ve 21 gün) aşağıdaki farklı zaman noktalarında, fareler tekrar rotarod cihaz üzerinde test edilmiştir. Yaralanma sonrası rotarod testlerin değerlendirilmesi başlangıçtaki gecikmeleri 22 göre bireysel puanları dayanmaktadır. Yaralı farelerin düşmesi ortalama gecikme sahte fareler karşılaştırılır. Bilişsel fonksiyonu aşağıdaki LFP Morris Su Labirent (MWM), kemirgenler 23 posttravmatik uzamsal öğrenme ve çalışma belleği hassas bir ölçü kullanarak farelerde ayrı bir set test edilebilir. Fare paradigma acclimated ve temel yanıt için 4 gün önce yaralanma görülebilir bir platform testi kullanılarak test edilmektedir. Beyaz yuvarlak yüzme havuzu (1 m çap), su ve toksik olmayan beyaz boya ile doldurulur. Platformu duvarlarda bir bayrak ya da marker ve hiçbir görsel ipuçlarını kullanarak görünür hale getirilir. 4 çalışma içinde, fare görünür platformunun karşısında kadranda yerleştirilir ve platform bulmak için gecikme ölçülür. Maksimum deneme süresi 60 sn ve fare kalır ya da her deneme sonunda 15 saniye için bir platform üzerine yerleştirilmiştir. Intertrial aralığı fare bir ısıtma yastığı ısınması sırasında 5 dakika. Platform, her deneme için farklı bir kadranda taşınır ve dört çalışma yapılmaktadır. Öğrenmelerini değerlendirmek için, fareler yaralanma (genellikle 1, 7 ve 21 gün) sonra, çeşitli zaman noktalarında 4 kadranın bir sabit gizli bir platformu kullanarak MWM eğitilmiştir. Siyah ve beyaz ipuçları duvarlara yerleştirilir. Fare konduğu kadranda pseudorandomly platform kaydedilir bulmak için eğitim süresi boyunca çok çeşitlidir. Maksimum deneme süresi 60 sn ve fare kalır ya da 15 saniye için bir platform üzerine yerleştirilen ve çalışmalar arasındaki 5 dakika süreyle ısıtılır. Fare, 3 gün üst üste 8 deneme / gün 'e tabi tutulur. Hafıza tutma değerlendirmek için, hayvanların son eğitimini takiben gün 60 sn probu yargılanma tabi tutulur. Prob deneme sırasında, platform zaman geçirdim ve platform olarak kullanılan kadranda mesafe yapılırsa yapılsın belirlemek için kaldırılır. Son olarak, gözle görülür bir platform testi mümkün motor ve zarar sonrası gelişen görme kusuru ekarte etmek için yapılır. LFP yaralanma histolojik sonuçları belirlemek için, doku NaCl,% 4, yaralanma sonrası istenilen zaman noktalarında paraformaldehid takip% 0.9 intrakardiyak perfüzyon ile sabittir. Doku 4 geceleme postfixed ° C ve daha sonra% 10 ve% 30 sukroz ve gömme çözüm cryoprotected. Dondurulmuş seri bir Kriyostat bölümleri kesilerek ve çeşitli immuohistochemical ve histolojik teknikler kullanarak işlenir. 4. Temsilcisi Sonuçlar: LFP cihaz tarafından uyarılan yaralanma yeterli cerrahi eğitimi ile, özellikle hayvandan hayvana tekrarlanabilir. Yaralanma tutarlılığı sağlamak için, cihaz tarafından dura teslim basınç miktarı izlenir. Sarkaç hayvan kraniektomi sitesi (Şekil 1A) yapıştırılmış yaralanma hub'a bağlı olan yüksek basınçlı boru ve Luer-lok uydurma bir su dolu akrilik silindir vurur. 2.1 atm ve bir amplifikatöre bağlı bir osiloskop basınç darbesi (Şekil 1B) görselleştirmek için kullanılır – orta hafif bir yaralanma, sarkacın açısı 0.9 arasında değişen bir basınç oluşturmak için ayarlanır. Sakatlık refleks süreleri ve pulmoner ödem ile ilgili giderek artan bir ölüm doğrulan bir dizi üretir. 4 dakika ve 0 -% 5 ölüm oranı Hafif yaralanma 2 düzeltilmesi refleks süresi olarak kabul edilmektedir. 10 dakika ve 10 -% 20 ölüm oranı Orta yaralanma 6 düzeltilmesi refleks süresi olarak kabul edilmektedir. Ayrıca, LFP tabi fareler nöbet göstergesi olabilir tonik tavır gösterebilir. Nöbet genellikle bir tehlikeye dura ile ilişkilidir. Birlikte, bu bulgular, yaralanma nörolojik hasara neden olduğunu düşündürmektedir. Şam hayvanlar LFP cihaza bağlı olan ancak sarkaç serbest bırakılmaz. LFP tarafından uyarılan hasar görselleştirmek için, biz bir yanıt yaralanma ile ilişkili hücre tiplerinin her ikisi de makrofajlar farkındayız astrositler ve antikorlar kullanarak immünsitokimya gerçekleştirdik. Glial fibriller asidik protein (GFAP) boyama bölgede yaralanma wh korteks boyunca artış gliozis ortaya koymaktadırereas sahte fareler kraniektomi altında eşdeğer bir site (Şekil 2A, B) artış astrocytosis görüntülenmez . Benzer şekilde, MAC1 boyama yaralanma site çevreleyen sham maruz farelere kıyasla daha fazla makrofaj göstermektedir. Buna ek olarak, sık sık kortikal doku değil, sahte farelerde (Şekil 2C ve D) olarak LFP maruz kalan farelerde görünür fiziksel hasar var. Hafif LFP sonrası davranış testi hem de bilişsel ve motor sonuçlarını değerlendirmek için kullanılabilir. MWM öğrenme ve hafıza üzerine etkilerini belirlemek için kullanılır. Test odası görsel ipuçlarını kullanarak, sahte fareler, sonraki her gün su labirenti eğitim platformu yerini hızla daha verimli oldu. Fare hafif LFP tabi ama sonra üçüncü gün (Şekil 3A) görev öğrenmek için sahte farelere göre test ilk iki gün gizli bir platform bulmak için uzun sürer . Bu bulgular, yaralanma farelerin mekansal öğrenme edinebilirler oranını azalttığını göstermektedir. Hafıza tutma yaralanma etkisini belirlemek için, bir sonda deneme son antrenmandan sonra 1 gün yapılır. Şam fareler hedef kadranda hafif LFP yaralanma platform ikamet için kullanılır (Şekil 3B) konumunu hatırlamak için farelerin yeteneği etkiledi tabi farelere göre daha fazla zaman geçirirler. Lokomotor fonksiyonunu değerlendirmek için, fare rotarod cihaz üzerinde test edilmektedir. Hafif LFP maruz Fareler, 1, 7 ve 21 gün yaralanma (dpi) (Şekil 3C) sahte farelere kıyasla düşmeye kısa ortalama gecikme var . Bu veriler, yaralı fareler entegre vestibulomotor ve sensorimotor fonksiyon engelli olduğunu göstermektedir. Şekil 1 LFP cihaz ve yaralanma sırasında elde edilen osiloskop bir temsilci iz. A) LFP cihazın bileşenleri şunlardır: sarkaç, istenilen güç, yüksek basınçlı boru ve bağlı bir erkek Luer-lok uydurma, bir amplifikatör ile akrilik silindir dolu bir su sağlamak için önceden belirlenmiş bir açıyla bir stand ve set sabit ve osiloskop. B) basıncı nabız osiloskop Temsilcisi iz. Peak-tepe değeri 1.47 atm basınç gösteren 2.16 volttur. Şekil 2 LFP aşağıdaki Gelişmiş gliozis ve inflamatuar bir yanıt yaralanma ölçüde göstermektedir. Sham (A, C) veya LFP yaralanma (B, D) 7 gün yaralanma (dpi) tabi bir fare beyin aracılığıyla Dondurulmuş enine bölümler (20μm). Kortikal görüntüleri kraniektomi merkez üssü alınır. (A, B) Doku astrositler tanımlamak için bir antikor ile boyandı. Glial fibriller asidik protein (GFAP) antikoru (MAB360, Chemicon, 1:400) sham göre LFP yaralanma (oklar) tabi fare korteks boyunca daha yüksek bir sayıda astrositler ortaya koymaktadır. İkincil antikor keçi anti-fare 594 (1:1000). (C D) Doku makrofajlar tanımlamak için bir antikor ile boyandı. MAC1 antikor (MAC1-alfa zinciri CD11b, BD Biosciences, 1:50) sham göre, etrafında daha fazla macrophges ve / veya aktif mikroglia korteks (oklar) yaralanma site ortaya koymaktadır. İkincil antikor keçi anti sıçan CY3 (1:50). C ve D, A ve B, 100μm Ölçek çubuğu = 200μm Şekil 3 hafif LFP aşağıdaki Davranış test, sahte farelere göre yaralı eksiklikler göstermektedir . A) hafif LFP tabi Fareler sahte farelere göre daha MWM platformu bulma görevi öğrenmek için daha uzun sürebilir. Şam vs LFP (ave saniye ± SEM) 1 gün 34.21 ± 3.02 vs 38,64 ± 2.63, 2. gün 24.52 ± 2.84 vs 27.21 ± 2.11, 3 gün 22,47 ± 2.00 vs 22.08 ± 2.52 (1 dpi, n = 9 sahte, 10 LFP) . B) hafif LFP tabi Fareler MWM akrabası sahte fareler (21 dpi, n = 10) en son eğitim sırasında hedef kadranda sonra prob deneme 24 saat daha az zaman harcar. C) hafif LFP maruz Fare rotarod cihaz er düşmenize sahte farelere göre (1, 7, ve 21 dpi, n = 5 sahte, 8 LFP). Hata çubukları GD temsil eder.