Lateral Fluid-Percussion: Modell Schädel-Hirn-Verletzungen in Mäuse

1. Kraniektomie Eine sterile OP-Gebiet ist mit einer stereotaktischen Ausrichtung Instrument (Kopf Instruments) für Mäuse mit einer Maus Gas Anästhesie Kopfhalter (Kopf Instruments) verbunden mit einem Narkosegerät mit O 2 flush (Parkland Scientific) bereit, für die kontinuierliche Inhalation von Isofluran während der Operation ermöglichen . Eine wärmende Unterlage gehalten bei 37 ° C unter der Maus während der Operation positioniert. Ein Operationsmikroskop und Lichtquelle benötigt wird. Der Versuchsleiter sollten einen Kittel, Mundschutz, Fußbekleidung, Handschuhe und Kopfbedeckung. Alle Werkzeuge und Materialien, die die chirurgische Ansprechpartner vor Ort sollte sterilisiert werden. Eine Verletzung Hub, bestehend aus dem weiblichen Ende eines Luer-Lok wird durch das Abschneiden der Metall-Ende einer 20 g 1 ½ "-Nadel (Becton Dickinson) mit einer Rasierklinge. Die Nabe sollte mit einem leichten Bias geschnitten und erstellt einen etwa 3mm Innendurchmesser Öffnung. Der Trepan (siehe Schritt 1,10) kann zur Messung und Herstellung einer Verletzung Drehscheibe der richtige Durchmesser. Ein Hub ist pro Tier erforderlich. Der Hub wird an den Schädel befestigt werden und an die LFP Gerät an den Puls der Druck zu liefern. Solide Nylonschnur (1,7 mm Durchmesser, z. B. Unkraut Trimmer Linie) ist in ca. 1 mm dicke Scheiben mit einer Rasierklinge geschnitten. Auch hier ist eine Platte pro Tier erforderlich. Dies dient dazu, die Trepan stabilisieren, während der Durchführung der Kraniektomie (siehe Schritt 1,10). Mäuse können von jedem Stamm und Alter (- 9 Monaten haben wir in erster Linie nutzen C57BL / 6 Altersklassen 1). Die Maus wird gewogen und betäubt in einer kleinen Kammer Induktion (mit 4-5% Isofluran in 100% O 2 vorgefüllt) für mindestens 1 Minute. Für präventive Analgesie, ist eine Injektion von buprenorphrine (0,1 mg / kg) intraperitoneal gegeben und die Maus ist wieder in die Kammer für eine weitere Minute platziert. Analgetische Therapie sollte durch Beratung mit lokalen Tier-Nutzung und Pflege Ausschuss bestätigt werden. Die Haare auf der Oberseite der Maus ist der Kopf so nah an der Haut wie möglich beschnitten. Die Maus ist in einem stereotaktischen Ausrichtung Instrument mit Biss-plated entwickelt, um flüchtige Gas Anästhesie (Kopf Instruments) verwalten ausgestattet positioniert. Die Höhe der Isofluran-Gas ist auf 2% oder wirksam reduziert. Atemfrequenz wird visuell während der Operation überwacht. Andere physiologische Parameter wie Blutgase (p O 2, p CO 2), Blut-pH-oder Blutdruck gemessen werden entsprechende Geräte während des Verfahrens sein. Künstliche Tränen Schmiermittel Augensalbe auf die Augen von der Maus mit einem Baumwoll-Applikator, um sie vor dem Austrocknen bewahren setzen. Povidon-Iod wird auf die Haut zwischen den Augen und den Hals mit einem Baumwolltuch Applikator von 70% Alkohol, gefolgt angewendet. Die Anwendung von PVP-Jod und Alkohol ist für insgesamt 3-mal wiederholt. Eine Mittellinie Kopfhaut Schnitt wird von den Augen bis zum Hals gemacht mit einem Skalpell (# 15 Klinge) und die Haut mit einem kleinen Bulldogklemmen eingefahren (Fine Science Tools # 18050-28), um den Schädel zu entlarven und eine klare OP-Feld. Die Bulldogklemmen hängen von der seitlichen Ränder des Schädels. Lokalanästhetikum Bupivacain (0,025% in Kochsalzlösung) ist es, den Schädel mit einem Baumwoll-Applikator und die Faszie aus dem Schädel mit der Spitze der zahnärztlichen Werkzeug oder Knochen Schaber (z. B., Fine Science Tools, # 10075-16) abgeschabt angewendet. Ein Permanent-Marker wird verwendet, um den Schädel auf halbem Weg zwischen Bregma und Lambda und zwischen den Sagittalnaht und seitliche Bergrücken über der rechten Hemisphäre (~ 2 mm rechts von der Mittellinie) zu markieren. Ein Tropfen Loctite Sekundenkleber (Loctite Tak Pak 454) ist in einem Kunststoffgehäuse setzen wiegen Boot und Seite Fasszange (Fine Science Tools, Dumont Nr. 6) werden verwendet, um eine Scheibe aus weed festen Nylon-Schnur (siehe 1.3) in die Senke Klebstoff und drücken Sie dann die Festplatte, auf die Markierung auf dem Schädel. Ein bis zwei Tropfen der Loctite Accelerator ist auf der Oberseite der Scheibe mit einer 1 ml Spritze und 26 8.3 G Nadel, um die Härten des Klebers verursachen geliefert. Testen Sie die Einhaltung der Scheibe auf den Schädel, bevor Sie fortfahren. Legen Sie eine 3 mm Außendurchmesser Trepan (Research Instrumentation Shop, University of Pennsylvania) über die Scheibe und im Uhrzeigersinn, bis Sie durch Schädel geschnitten haben zu spinnen. Überprüfen Sie die Trepan die Fortschritte häufig Bohrungen zu weit in den Schädel und Verletzung der Dura zu vermeiden. Es wird eine Ausdünnung des Schädels um den Umfang der Scheibe und des Schädels Klappe fühlen sich locker, wenn sie gedrückt leicht. Legen Sie die zahnärztliche Werkzeug parallel / horizontal auf den Schädel der Oberfläche, um unter dem Schädel aufzubrechen und heben den Knochendeckel auf. Nehmen Sie den Knochen aus dem Schädel mit einer Pinzette. Wenn es eine kleine Menge von Blutungen, ohne Kompromisse der Dura, verwenden Sie ein Baumwoll-Applikator, um Druck auszuüben, bis die Blutung stoppt und verhindert Knochen von Staub auf die Dura. Allerdings, wenn ein Verstoß in der Dura, so dass Bandscheibenvorfall sichtbar ist, sollte das Tier aus dem Experiment durch humane Euthanasie eliminiert werden. Dieser Schritt erfordert eine ausreichende praktische ErfahrungZur Erreichung der chirurgischen Geschick erforderlich. Mit einer Pinzette, halten die Verletzung Nabe in Position über dem Kraniektomie in den Schädel, so dass die Vorspannung der Nabe mit der Krümmung des Schädels (dh die längere Kante der Nabe liegt in der Nähe der seitlichen Kante des Schädels) ausgerichtet ist. In der Zwischenzeit mit dem Holzstäbchen, in einem Winkel mit einer Rasierklinge geschnitten, um eine scharfe Spitze haben, gelten Superkleber Gel um die Außenkanten der Hub mit der anderen Hand und stabilisieren die Nabe, bis es senkrecht über dem Loch befestigt. Es muss darauf geachtet nicht zu kleben auf der Dura zu erhalten. Kleber auf der Dura bewirkt eine Dämpfung der Verletzung. Mit einem kleinen Pappbecher, mischen Methylmethacrylat zahnärztliche Acryl (Jet Acrylic Liquid mit Perm Reline / Reparatur Resin, Butler Schein), um eine viskose Lösung zu schaffen. Verwenden Sie eine 1-ml-Spritze ohne Nadel zu Zement in der ganzen Verletzungen Hub gelten. Der Zement sollte sich auf der Unterseite 2 mm von der Verletzung Hub sowie die umliegenden ausgesetzt Schädel. Die Schädelnähte sind mit dem Zement versiegelt, um sicherzustellen, dass die Flüssigkeitsbolus aus der Verletzung innerhalb der Schädelhöhle bleibt. Füllen Sie den Hub mit steriler 0,9% NaCl (Kochsalzlösung) mit einer Spritze und Nadel stumpf. Die Kochsalzlösung wird die Dura feucht während der Erholungsphase zu halten. Darüber hinaus, wenn die Verletzung Nabe nicht gefüllt bleiben, werden die darauf hinweisen ein Leck in der Nabe-Verbindung auf den Schädel und eine neue Nabe gelegt werden sollte. Die Maus sollte ein 0,25 ml Injektion von steriler Kochsalzlösung IP, von der stereotaktischen Ausrichtung Instrument entfernt und in einen leeren Käfig ohne Draht bar Deckel auf eine Warmhalteplatte gegeben werden. Legen Sie einige HydraGel auf dem Boden des Käfigs und damit die Mäuse für 1-2 Stunden zu erholen. 2. Induktion von Verletzungen Schalten Sie das Oszilloskop (Tektronix TDS 1001B, Zwei-Kanal Digi-Oszilloskop 40 MHz, 500Ms.s) und Verstärker (Trauma Inducer Druckaufnehmer Amplifier), die den LFP-Gerät angeschlossen ist. Bestätigen Sie, dass die LFP-Gerät (Custom Design und Fertigung, Virginia Commonwealth University) und der Hochdruck-Schlauch (Länge 41cm, Volumen 2ml, Baxter # 2C5643) verbunden, um es mit sterilem Wasser gefüllt sind und frei von Luftblasen. Am Ende des Schlauchs ist ein männlicher Luer-lok Stück. Mit dem Luer-lok Ende des Schlauches geschlossen, liefern Prüfimpulse durch Loslassen des Pendels. Das Gerät sollte durch die Bereitstellung etwa 10 Prüfimpulse grundiert werden. Bestätigen Sie, dass Pendels liefert glatt auf dem Oszilloskop und Verstärker. Eine laute Signal zeigt an Luft im System, die vor müssen für die Bereitstellung der Verletzung Puls entfernt werden. Die Dauer des Impulses sollte ca. 20 ms. Die Wandler-Verstärker mit der LFP Gerät geliefert wird, so dass 10 mV = 1,0 Pfund pro Quadratzoll (PSI). Kalibriert Eine Atmosphäre (ATM) = 14,7 PSI. Injury Druck geliefert werden in der Regel im Bereich von 0,9 bis 2,1 Atmosphären zu einer Reihe von Gleichgewichtsreflexes Zeiten und eine zunehmende Sterblichkeit mit Lungenödem assoziiert zu produzieren. Mild Verletzung gilt als Gleichgewichtsreflexes Zeit von 2 bis 4 min und einer von 0 bis 5% Sterblichkeit. Mittelschweren Verletzungen gilt als Gleichgewichtsreflexes Zeit von 6 bis 10 min und einem 10 bis 20% Sterblichkeit. Wenn nötig, stellen Sie den Winkel des Pendels zu erhöhen oder verringern die Intensität des Pulses. Der Winkel des Pendels Ausgangsposition ist etwa 10 Grad. Nach dem Einstellen des LFP-Gerät, müssen Sie den Luer-Lok Ende des Schlauchs geöffnet. Die Maus ist in den 4-5% Isofluran-Narkose Kammer (vorgeladen), bis eine chirurgische Ebene der Narkose erreicht ist gelegt. Die Maus ist auf einer Plattform neben dem LFP-Gerät platziert und die Nabe mit einer sterilen Kochsalzlösung gefüllt. Der Schlauch der LFP-Gerät mit einem männlichen Luer-Lok ist die weibliche Luer-Lok Montage der Nabe befestigt. Das Tier ist auf seiner Seite und einmal eine normale Atmung wieder gestellt, aber vor dem Tier Wiedererlangung vollem Bewusstsein (~ 2 min), das Pendel der LFP-Gerät wird freigegeben, um einen einzigen Impuls von Verletzungen verursachen. Es ist wichtig, nicht induzieren die Verletzungen, während das Tier ist zu betäubt, wie es Lungenversagen und Tod führen konnte. Der genaue Druck der Puls sollte aufgezeichnet werden. Unverletzt, erleiden sham Tiere alle von der gleichen Verfahren mit Ausnahme der eigentlichen Fluidpuls, um Verletzungen zu induzieren. Das Tier sollte sofort aus dem LFP Gerät entfernt werden und auf dem Rücken zum Aufrichten Reflex zu überwachen. Nach der Maus selbst richtete, ist es dann kurz betäubt wieder und der Zement-und Nabe zusammen aus dem Schädel von Hand entfernt. Die Kopfhaut wird dann mit Vetbond Gewebekleber (3M), Nahtmaterial oder Klammern geschlossen. Jede Herniation der Dura oder Okklusion der Nabe wird darauf hingewiesen. Eine verstopfte Hub produzieren eine abgeschwächte Verletzung von unbekannter Größe. Das Tier ist zurück in den Käfig auf eine wärmende Unterlage gelegt, bis der ambulanten und kehrte dann nach seinen eigenen Käfig. 3. Beurteilung der motorischen, kognitiven und histologische Ergebnisse Der motor Defizite durch LFP verursacht werden, können mit Hilfe der Rotarod Test, ein Indikator für die integrierte vestibulomotor und sensomotorische Funktion 21 bestimmt werden. Alle Tiere müssen vor Verletzungen geprüft werden, um eine Grundlinie Lesen zu bestimmen und die Mäuse auf dem Paradigma zu akklimatisieren. Mäuse sind auf dem Rotarod Gerät 3 mal pro Tag mit 1-Stunden-intertrial Intervalle für die zwei Tage vor der Verletzung trainiert. Die Latenz auf einem 36-mm Außendurchmesser, rotierenden Stange, die eine Gummi-Oberfläche Gleichgewicht gemessen wird. Die Geschwindigkeit erhöht sich von 4 bis 40 Umdrehungen pro Minute über einen 180 sec Intervall. Jeder Versuch endet, wenn das Tier fällt vom Rotarod. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Verletzung (in der Regel 1, 7 und 21 Tage) werden die Mäuse wieder auf die Rotarod Gerät getestet. Evaluation der Rotarod Tests nach der Verletzung auf die einzelnen Noten im Verhältnis zu ihrem Ausgangswert Latenzen 22 basierend. Die durchschnittliche Latenz von verletzten Mäuse fallen wird, dass der Schein-Mäusen verglichen. Kognitive Funktion folgende LFP kann auf einem separaten Satz von Mäusen mit dem Morris Water Maze (MWM), ein empfindliches Maß für posttraumatische räumlichen Lernen und Arbeitsgedächtnis bei Nagern 23 getestet werden. Mäuse sind das Paradigma gewöhnt und getestet, um grundlegende Reaktion mit einer sichtbaren Plattform Test 4 Tage vor der Verletzung. Eine weiße, runde Pool (1 m Durchmesser) wird mit Wasser und ungiftigen weißer Farbe gefüllt. Die Plattform wird sichtbar gemacht mit einer Fahne oder eines Markers und keine visuellen Hinweise sind an den Wänden. In 4 Studien, ist die Maus in den Quadranten gegenüber, dass der sichtbare Plattform gestellt und die Latenz, die Plattform zu finden, ist vermessen. Maximale Testzeit beträgt 60 sec und die Maus bleibt oder auf der Plattform für 15 sec am Ende jedes Gericht gestellt. Die intertrial beträgt 5 min, während der die Maus auf einem Heizkissen erwärmt wird. Die Plattform ist auf einem anderen Quadranten für jeden Versuch bewegt und vier Studien durchgeführt werden. Um zu beurteilen, Lernen, sind Mäuse auf dem MWM mit einer versteckten Plattform in einem der 4 Quadranten zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Verletzung (in der Regel 1, 7 und 21 Tage) fixiert geschult. Schwarz-Weiß-Signale werden an den Wänden platziert. Der Quadrant, in dem die Maus befindet sich pseudozufällig gesamten Ausbildung und die Zeit zum Auffinden der Plattform registriert ist vielfältig. Maximale Testzeit beträgt 60 sec und die Maus bleibt oder auf der Plattform für 15 sec gelegt und erwärmt für 5 min zwischen Studien. Mäuse sind zu 8 Studien / Tag für 3 aufeinanderfolgende Tage ausgesetzt. Um zu beurteilen, Merkfähigkeit, sind die Tiere in ein 60 sec Sonde Studie unterzogen Tag nach dem letzten Training. Während die Sonde Studie ist die Plattform entfernt, um die Zeit und Distanz geschwommen in den Quadranten, wo die Plattform verwendet werden, um zu bestimmen. Schließlich ist eine sichtbare Plattform-Test durchgeführt, um auszuschließen, möglich motorische und visuelle Defizite, die nach der Verletzung entwickelt. Zur Bestimmung der histologischen Folgen der LFP Verletzung wird Gewebe durch intrakardiale Perfusion mit 0,9% fester NaCl gefolgt von 4% Paraformaldehyd in gewünschten Zeitpunkten nach der Verletzung. Das Gewebe wird über Nacht bei 4 ° C postfixed und dann in 10% cryoprotected und 30% Saccharose und Einbettung Lösung. Gefrorene Schnittserien sind auf einem Kryostat geschnitten und verarbeitet mit verschiedenen immuohistochemical und histologischen Techniken. 4. Repräsentative Ergebnisse: Die Verletzungen, die durch die LFP Gerät induziert wird reproduzierbar von Tier zu Tier, insbesondere mit ausreichend chirurgische Ausbildung. Um die Konsistenz der Verletzung, ist die Höhe des Drucks geliefert an die Dura vom Gerät überwacht. Das Pendel schlägt einen mit Wasser gefüllten Acrylzylinder mit Hochdruck-Schlauch und Luer-Lok montiert, der nach der Verletzung Nabe angebracht, um die Kraniektomie Website auf das Tier (Abbildung 1A) verbunden ist. Für eine leichte bis moderate Verletzungen, ist der Winkel des Pendels auf einen Druck von 0,9 generieren – 2,1 atm und ein Oszilloskop an einen Verstärker angeschlossen wird verwendet, um den Druck-Impuls (Abbildung 1B) zu visualisieren. Injury produziert eine Reihe von Gleichgewichtsreflexes Zeiten und eine zunehmende Sterblichkeit mit Lungenödem verbunden. Mild Verletzung gilt als Gleichgewichtsreflexes Zeit von 2 bis 4 min und einer von 0 bis 5% Sterblichkeit. Mittelschweren Verletzungen gilt als Gleichgewichtsreflexes Zeit von 6 bis 10 min und einem 10 bis 20% Sterblichkeit. Darüber hinaus können Mäuse unterzogen LFP weisen Tonic Pose, die auf eine Beschlagnahme. Die Beschlagnahme ist oft mit einem kompromittierten dura verbunden. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse, dass die Verletzung verursacht neurologische Schäden. Sham Tiere werden der LFP-Gerät angeschlossen, aber das Pendel nicht freigegeben. Zur Visualisierung der Schäden, die durch LFP induziert, haben wir Immunzytochemie unter Verwendung von Antikörpern, die Astrozyten und Makrophagen die beide Zelltypen mit einer Reaktion auf eine Verletzung verbunden sind, zu erkennen. Sauren Gliafaserproteins (GFAP) Färbung zeigt erhöhte Gliose in der Hirnrinde in der Region von Verletzungen whereas sham Mäuse zeigen keine erhöhte Astrozytose in die entsprechende Website unter der Kraniektomie (Abb. 2A, B). Ebenso zeigt MAC1 Färbung mehr Makrophagen rund um den Ort der Verletzung im Vergleich zu Mäusen unterzogen sham Operation. Darüber hinaus gibt es häufig körperliche Schäden an der kortikalen Gewebes sichtbar in Mäusen unterzogen LFP, aber nicht in Schein-Mäusen (Abbildung 2C, D). Behavioral Tests folgende mild LFP können sowohl kognitive und motorische Ergebnisse zu beurteilen. MWM wird verwendet, um Auswirkungen auf Lernen und Gedächtnis zu bestimmen. Mit visuellen Hinweisen in den Testraum, Schein-Mäusen wurde schnell effizienter Lokalisierung der Plattform mit jedem weiteren Tag der Ausbildung im Wasser Labyrinth. Mäuse unterzogen mild LFP länger dauern, bis die versteckte Plattform, auf die ersten beiden Testtage in Bezug auf sham Mäuse finden aber dann erscheint die Aufgabe, am dritten Tag (Abbildung 3A) zu lernen. Diese Befunde legen nahe, dass die Verletzung der Rate, mit der die Mäuse räumlichen Lernens erwerben können reduziert. Zur Bestimmung der Wirkung von Verletzungen auf Gedächtnisleistung, wird eine Sonde Studie durchgeführt 1 Tag nach der letzten Trainingseinheit. Sham-Mäuse mehr Zeit in die Ziel-Quadranten im Vergleich zu den Mäusen unterzogen mild LFP darauf hindeutet, dass die Verletzung hat die Fähigkeit der Mäuse, um den Speicherort, wo die Plattform zuvor seinen Wohnsitz hatte (Abbildung 3B) Rückrufaktion betroffen. Um zu beurteilen, Bewegungsapparat-Funktion werden die Mäuse auf dem Rotarod Gerät getestet. Mäuse unterzogen mild LFP haben kürzere durchschnittliche Latenzzeit im Vergleich zu den schein-Mäusen bei 1, 7 und 21 Tage nach der Verletzung (dpi) (Abbildung 3C) fallen. Diese Daten deuten darauf hin, dass Geschädigte Mäuse haben integrierte vestibulomotor und sensomotorische Funktion beeinträchtigt. Abbildung 1. LFP-Gerät und einem Vertreter Spur vom Oszilloskop während Verletzungen erhalten. A) Die Komponenten des LFP-Gerät: das Pendel an einem Stativ und stellen Sie in einem Winkel vorgegeben, um die gewünschte Kraft, einem mit Wasser gefüllten Acrylzylinder mit Hochdruck-Schläuchen und einem männlichen Luer-Lok Montage angebracht, einen Verstärker liefern feste, und ein Oszilloskop. B) Vertreter Spur Druckimpuls vom Oszilloskop. Die Peak-to-Peak-Wert ist 2.16 Volt zeigt einen Druck von 1,47 atm. Abbildung 2. Verbesserte Gliose und eine entzündliche Reaktion folgende LFP zeigt das Ausmaß der Verletzung. Gefrorene Querschnitten (20 um) durch das Gehirn einer Maus unterzogen sham Operation (A, C) oder LFP Verletzungen (B, D) 7 Tage nach der Verletzung (dpi). Kortikale Bilder sind im Epizentrum der Kraniektomie genommen. (A, B) Tissue ist mit einem Antikörper gegen Astrozyten identifizieren gefärbt. Sauren Gliafaserproteins (GFAP)-Antikörper (MAB360, Chemicon, 1:400) offenbart eine höhere Anzahl von Astrozyten in der Rinde der Maus unterzogen LFP Verletzungen (Pfeile) im Vergleich zu den schein-Chirurgie. Sekundäre Antikörper Ziege anti-Maus 594 (1:1000). (C. D) Tissue ist mit einem Antikörper gegen Makrophagen identifizieren gefärbt. MAC1 Antikörper (MAC1-alpha-Kette CD11b, BD Biosciences, 1:50) offenbart mehr macrophges und / oder aktivierte Mikroglia um den Ort der Verletzung in der Großhirnrinde (Pfeile) im Vergleich zu den schein-Chirurgie. Sekundäre Antikörper Ziege anti Ratte CY3 (1:50). Maßstab = 200 um in A und B, 100 um in C und D. Abbildung 3. Behavioral Tests folgende mild LFP zeigt Defizite in Verletzten im Vergleich zu den schein-Mäusen. A) Mäuse unterzogen mild LFP länger dauern, bis die Aufgabe, die Plattform in der MWM als Schein-Mäusen zu lernen. Sham vs LFP (ave Sekunden ± SEM) 1 Tag 34,21 ± 3,02 vs 38,64 ± 2,63; 2 Tage 24,52 ± 2,84 vs 27,21 ± 2,11; 3 Tage 22,47 ± 2,00 vs 22,08 ± 2,52 (1 dpi, n = 9 sham, 10 LFP) . B) Mäuse unterzogen mild LFP verbringen weniger Zeit in der Ziel-Quadranten während die Sonde Studie 24 Stunden nach dem letzten Training in der MWM gegenüber sham-Mäuse (21 dpi, n = 10). C) Mäuse unterzogen mild LFP aus dem Rotarod Gerät früher sinken als Schein-Mäusen (1, 7, und 21 dpi, n = 5 Schein, 8 LFP). Fehlerbalken stellen SE.