Vibratome Sectioning للحفاظ على المحسن من التهندس الخلوي للجهاز الثدييات كورتي
Summary
يوصف إجراء بسيط من vibratome sectioning الجهاز كورتي ، تليها المجهري ومبائر المناعية. يسمح هذا الإجراء للحفاظ على تحسن من التهندس الخلوي غرامة الجهاز الثدييات كورتي ، ويسمح بالتالي لتقدير دقيق لأنواع الخلايا.
Abstract
الجهاز الثدييات كورتي هو أمر غاية الخلوية فسيفساء من الشعر mechanosensory nonsensory والخلايا المساندة
(إعادة النظر في 1،2). التصور من هذه الفسيفساء الخلوية وغالبا ما يتطلب أن جهاز كورتي هو عبر مقطوع. على وجه الخصوص ، يمكن للعمود nonsensory دايترس والخلايا '، التي تقع النواة basally فيما يتعلق خلايا الشعر ، لا يمكن تصور دون sectioning عبر جهاز كورتي. ومع ذلك ، فإن التهندس الخلوي الحساسة للجهاز كورتي الثدييات ، بما في ذلك العمليات السيتوبلازمية الدقيقة للعمود والخلايا دايترس '، من الصعب الحفاظ على النسيجية من خلال إجراءات روتينية مثل البارافين والبرد sectioning ، والتي تتوافق مع معيار تقنيات تلطيخ المناعى.
هنا أصف إجراء بسيط وقوي يتألف من vibratome sectioning من القوقعة ، وتلطيخ المناعى من هذه المقاطع vibratome في جبل بأكمله ، تليها المجهري متحد البؤر. وقد استخدم هذا الإجراء على نطاق واسع لتحليل immunhistochemical أجهزة متعددة ، بما في ذلك الماوس برعم الطرف ، الزرد الأمعاء والكبد والبنكرياس ، والقلب (انظر 3-6 لأمثلة مختارة). بالإضافة إلى ذلك ، كان هذا الإجراء سوسسفول] لكل من التصوير وquantitificaton من عدد الخلايا في العمود أجهزة متحولة والتحكم في كورتي في كل من الأجنة والبالغين 7 الفئران. هذا الأسلوب ، ومع ذلك ، لا يستخدم حاليا على نطاق واسع لفحص الجهاز من الثدييات كورتي. يوصف المحتملة لهذا الإجراء لتوفير الحفاظ على حد سواء المعزز للالتهندس الخلوي غرامة الجهاز الكبار كورتي ، والسماح للالكمي لمختلف أنواع الخلايا.
Protocol
Discussion
إجراءات sectioning vibratome ، تليها التصوير المناعية ومبائر يسمح التصور من جهاز كورتي مع الحد الأدنى من تلف الأنسجة. بوضوح ، وصور مأخوذة من مبائر المناطق الداخلية في المقطع vibratome تظهر الحفاظ ممتازة من التشكل الخلوية التي يقتصر فقط التحف التثبيت. صور مبائر المتخذة على مقربة م?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكاتب يعترف أن استخدام الأطفال الأساسية للأبحاث معهد التصوير المجهري مبائر والدكتور تشانغ جيان لاقتراح تحميل المقاطع باستخدام الخرز agarose. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح DC010387.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Leica VT1000S Vibrating Blade Microtome | Leica | ||
| Zeiss LSM510 laser scanning confocal microscope | Zeiss | ||
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| Peel-A-Way embedding mold | Polysciences | 18986 or 18646A | |
| bovine serum albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
| Goat Serum | Invitrogen | 16210-064 | |
| S100 | Dako | Z0311 | |
| Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-11036 | 1:1000 dilution |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| YO-PRO-1 | Invitrogen | Y3603 | |
| vacuum grease | Fisher | S41718 | |
| Affi-Gel Blue Gel | Bio-Rad | 153-7301 |
References
- Lim, D. J. Functional structure of the organ of Corti: a review. Hear Res. 22, 117-146 (1986).
- Raphael, Y., Altschuler, R. A. Structure and innervation of the cochlea. Brain Res Bull. 60, 397-422 (2003).
- Chung, W. S., Shin, C. H., Stainier, D. Y. Bmp2 signaling regulates the hepatic versus pancreatic fate decision. Dev Cell. 15, 738-748 (2008).
- Sun, X., Mariani, F. V., Martin, G. R. Functions of FGF signalling from the apical ectodermal ridge in limb development. Nature. 418, 501-508 (2002).
- Trinh, L. A., Stainier, D. Y. Fibronectin regulates epithelial organization during myocardial migration in zebrafish. Dev Cell. 6, 371-382 (2004).
- Yin, C., Kikuchi, K., Hochgreb, T., Poss, K. D., Stainier, D. Y. Hand2 regulates extracellular matrix remodeling essential for gut-looping morphogenesis in zebrafish. Dev Cell. 18, 973-984 (2010).
- Shim, K., Minowada, G., Coling, D. E., Martin, G. R. Sprouty2, a mouse deafness gene, regulates cell fate decisions in the auditory sensory epithelium by antagonizing FGF signaling. Dev Cell. 8, 553-564 (2005).
