Summary

تصوير الحية إزفاء PKC في Sf9 خلايا في الخلايا العصبية والحسية Aplysia

Published: April 06, 2011
doi:

Summary

في هذا الفيديو ، ونظهر تصور إزفاء PKC في الخلايا الحية باستخدام PKCS الموسومة fluorescently.

Abstract

بروتين كيناز جيم (PKCS) هي السيرين ثريونين كاينيسات التي تلعب دورا مركزيا في تنظيم مجموعة واسعة من العمليات الخلوية مثل نمو الخلايا والتعلم والذاكرة. هناك أربع عائلات معروفة من الأشكال الإسوية PKC في الفقاريات : PKCS الكلاسيكية (α ، βI ، وβII γ) ، اكتب رواية أنا PKCS (ε η و) ، رواية من النوع الثاني PKCS (δ وθ) ، وPKCS شاذة (وι ζ ). يتم تنشيط PKCS الكلاسيكية كا 2 + وdiacylclycerol (DAG) ، في حين يتم تنشيط PKCS رواية همرشولد ، ولكن كا 2 + مستقلة. يتم تنشيط PKCS شاذة التي لا كا 2 + ولا همرشولد. في californica Aplysia ، لدينا نظام نموذجي لدراسة تكوين الذاكرة ، وهناك ثلاثة نظام محدد العصبي الأشكال الإسوية PKC واحد من كل فئة رئيسية ، هي التقليدية PKC APL انا ، انا اكتب رواية PKC APL الثاني والثالث شاذة PKC الألغام المضادة للأفراد. PKCS والدهون تنشيط كاينيسات ، وبالتالي فقد تم تفعيل PKCS الرواية الكلاسيكية واستجابة لإشارات خارج الخلية مرتبطة بشكل متكرر مع إزفاء PKC من السيتوبلازم إلى غشاء البلازما. ولذلك ، تصور إزفاء PKC في الوقت الحقيقي في الخلايا الحية قد أصبحت أداة لا تقدر بثمن لتوضيح مسارات نقل الإشارة التي تؤدي إلى تفعيل PKC. على سبيل المثال ، سمحت هذه التقنية بالنسبة لنا لإثبات أن الأشكال الإسوية المختلفة من PKC نقل من مكان لآخر في ظل ظروف مختلفة للتوسط أنواع متميزة من اللدونة متشابك وأن السيروتونين (5HT) تفعيل PKC APL الثاني يتطلب إنتاج كل من حمض الفسفاتيديك همرشولد و(السلطة الفلسطينية) من أجل إزفاء 1-2. الأهم ، والقدرة على تصور الخلية العصبية نفسها مرارا وتكرارا وقد سمح لنا ، على سبيل المثال ، لقياس الحساسية للاستجابة PKC بالتفصيل رائعة 3. في هذا الفيديو ، ونظهر كل خطوة من إعداد الثقافات الخلية Sf9 ، وقد وصفت الثقافات من الخلايا العصبية الحسية Aplysia في مقال آخر فيديو 4 ، معربا عن PKCS الموسومة fluorescently Sf9 في الخلايا والخلايا العصبية في Aplysia الحسية والعيش التصوير من إزفاء PKC ردا على تفعيل مختلفة باستخدام الليزر المجهر.

Protocol

1. إعداد وصيانة Sf9 الثقافات المونولاير الخليوي يتم تنفيذ Sf9 خلية ثقافة والصيانة في نسيج الثقافة هود. وتستمد Sf9 خلايا من خلايا المبيض Spodoptera frugiperda (Sf21 الخلايا) ويمكن شراؤها على شكل خلايا مج?…

Discussion

وقد وصفت لدينا التقنية لإزفاء صورة PKCS fluorescently المفتاحية في الوقت الحقيقي في Sf9 الخلايا والخلايا العصبية في Aplysia الحسية. Sf9 الخلايا توفير نظام بسيط لإزفاء صورة PKC منذ زراعة وtransfecting لهم هي جميلة على التوالي إلى الأمام. في المقابل ، microinjection من الخلايا العصبية الحسية <…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الكندية لمنح الصحة (CIHR) بحوث لاين S. Sossin. كارول ألف فرح وهو حاصل على زمالة ما بعد الدكتوراه من فون بحوث دي لا سانتي ان كيبيك (FRSQ) وزمالة هارينجتون كونراد. فإن الكتاب أود أن أشكر جوانا بوجي ، مارغريت هاستينغز واللبان مارغريت للمساعدة في تبادل لاطلاق النار الفيديو ومادلين ريتشموند حمام سباحة للحصول على مساعدة مع نظرة عامة على الرسم.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Sf9 frozen cells Spodoptera frugiperda ovarian cells Invitrogen B825-01  
Grace’s Insect Medium, Supplemented (1X), liquid Reagent Gibco 11605-094 Use to culture Sf9 cells
Corning 75cm2 canted neck cell culture flask Tool Corning 430720 Use to culture Sf9 cells
Fetal Bovine Serum Reagent CanSera CS-C08-500 Supplement Grace’s media with FBS prior to use
Syringe Tool Becton Dickinson 309604 Use to filter Fast Green solution
Syringe Tool Becton Dickinson 309602 Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution
Filter Tool Corning 431229 Use to filter Fast Green solution
Filter Tool Corning 431212 Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution
Glass Bottom Dish Tool Mattek P35G-1.5-14-C Use to culture Sf9 cells prior to transfection and imaging
Cellfectin II Reagent Reagent Invitrogen 10362-100 Used to express fluorescently tagged PKCs in Sf9 cells
Fast Green FCF Reagent Sigma-Aldrich F-7252 Use to visualize microinjection of plasmid DNA solution into Aplysia sensory neurons
Thin wall glass capillaries Tool World Precision Instruments TW100F-4 Use to make microelectrodes for microinjection
Microloader pipette tip Tool Eppendorf CA32950-050 Autoclave before using to fill up the microelectrodes for microinjection
PV820 Pneumatic PicoPump Tool World Precision Instruments SYS-PV820 Part of microinjection station
Microelectrode holder Tool World Precision Instruments MPH6S Use to hold microelectrode
Micromanipulator Tool Sutter MP-85 Use to position microelectrode in the three-axis

References

  1. Farah, C. A., Nagakura, I., Weatherill, D., Fan, X. &. a. m. p. ;. a. m. p., Sossin, W. S. Physiological role for phosphatidic acid in the translocation of the novel protein kinase C Apl II in Aplysia neurons. Mol Cell Biol. 28, 4719-4733 (2008).
  2. Zhao, Y., Leal, K., Abi-Farah, C., Martin, K. C., Sossin, W. S. &. a. m. p. ;. a. m. p., Klein, . M.Isoform specificity of PKC translocation in living Aplysia sensory neurons and a role for Ca2+-dependent PKC APL I in the induction of intermediate-term facilitation. J Neurosci. 26, 8847-8856 (2006).
  3. Farah, C. A., Weatherill, D., Dunn, T. W. &. a. m. p. ;. a. m. p., Sossin, W. S. PKC differentially translocates during spaced and massed training in Aplysia. J Neurosci. 29, 10281-10286 (2009).
  4. Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures. J Vis Exp. , (2009).
  5. Manseau, F., Fan, X., Hueftlein, T., Sossin, W. S., Castellucci, V. F. Ca2+-independent PKC Apl II mediates the serotonin induced facilitation at depressed synapses in Aplysia. J. Neuroscience. 21, 1247-1256 (2001).

Play Video

Cite This Article
Farah, C. A., Sossin, W. S. Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons. J. Vis. Exp. (50), e2516, doi:10.3791/2516 (2011).

View Video