1. Inledning Målen för dessa laborationer är att förstå egenskaperna hos retbara membran, den joniska grunden för vila membran potential och metoder för att mäta membranpotential. Dessutom är färgning och histologi av muskel presenteras, som kan användas för att lära muskel struktur. Dessutom är två olika typer av dissekerade preparat som används för att visa egenskaper för synaptisk transmission i olika muskelgrupper. En komplett sensorisk-centrala nervsystemet (CNS)-motorneuron-muskel krets i kräftor buken är också används för att presentera en förberedelse för att undersöka sensorisk stimulering och påverkan från neromodulators och signalsubstanser på olika aspekter av en krets. Den första delen av denna rapport presenteras de metoder som använts för att mäta vila membran potential och påverkan av extracellulära K + på membranpotential. Vi kommer också att introducera muskel struktur. I den andra delen av detta arbete presenterar vi olika sätt att mäta synaptiska svar från olika typer av neuromuskulära korsningar (NMJs). Den första övningen använder kräftorna buken extensor muskler och den andra använder buken ytliga flexor musklerna. Dessutom presenterar vi en neural krets (den ventrala nerv ur kräftorna med sensoriska in-och utgångar motor) som är lätt att underhålla, och som kan användas för undervisning samt för forskning inom olika aspekter av en sensorisk-CNS -motorneuron-muskel krets. Efter genomgången förklaring av den inledande övningar, presenterar vi fysiologi NMJs och CNS krets. Den jon övertoning på ett biologiskt membran kan leda till en potentiell skillnad. För en cell i vila, är denna skillnad i elektrisk laddning genom cellmembranet kallas cellens vila membranpotential. Det finns två huvudsakliga faktorer vi kommer att ta upp som påverkar cellens membran potential. Den första är jonkoncentration på båda sidor av membranet. Den andra är joniska permeabiliteten i membranet. Det är viktigt att komma ihåg att i en levande cell finns det ett antal olika joner med olika koncentrationer i och utanför cellen. Det viktiga joner vi kommer att behandla är natrium (Na +), kalium (K +) och klorid (Cl-). De kvantiteter och transport av dessa joner i en muskel membran bestämmer membranpotential. Från denna grund kan vi ta itu med elektriska potentialer som observerats under elektrisk excitation och inhibition av ett membran från synaptiska svar och undersöka effekterna av farmakologiska medel. Vi kan också bygga biofysiska modeller för att representera dessa processer till experimentella testa koncept (Robinson et al., 2010). Användningen av glas kapillär microelectrodes tillåter inspelning av membran potential. Elektroden kan föras in genom cellmembranet utan skador, ger spetsen är tillräckligt liten och ett rättvisande mått på transmembrana potential kan erhållas. Tekniken är särskilt tillämpligt på stora celler, som är mindre benägna att skadas av införandet av den intracellulära elektroden. Detta är en av de grundläggande teknikerna i fysiologi. Balansen mellan Na + och K + över membranet upprätthålls av Na-K ATPas pump under fysiologiska förhållanden. Under normala förhållanden pumpen går i genomsnitt tre Na + ut ur cellen och två K + in i cellen. Som en sida noterar, var ett Nobelpris i kemi tilldelades 1997 för denna upptäckt gjordes redan i slutet av 1950-talet. Grunderna i upptäckten erhölls från forskning med axoner från en krabba (Skou, 1965, 1998). Denna pump anses också electrogenic eftersom den har en större förmåga att pumpa när membranet är depolarized (Skou, 1989a, b). I många celler, hastigheter pumpen när en cell är elektriskt aktiveras av depolarisation. Kalium kan även röra sig genom kalium "läcka" kanaler medan en cell är i vilotillstånd. På grund av dessa kalium läcker kanaler, är cellmembranet i vila mer genomsläpplig för kalium än för andra joner. Således är cellens vila membranpotential närmare jämvikt potential för kalium än för natrium. Den vilar membranpotential kan sedan undersökas för att se om det beror på kalium balans potential. 1) Muscle variabilitet Kräftdjur muskelfibrer visa större variation av strukturella drag, membran elektriska egenskaper och kontraktila egenskaper än gör ryggradsdjur muskelfibrerna. Phasic muskelfibrer i kräftdjur är modifierade för att rycka typ sammandragningar. De kännetecknas av korta sarcomere längder (2-4 mikron), tunna, raka Z-linjer, en låg andel av tunna till tjocka myofilamenten, och väl utvecklade system för T-tubuli och sarkoplasmatiskanätmagen. Phasic muskelfiber membran kan generera graderas eller allt-eller-inget aktionspotentialer. Tonic muskelfibrer, å andra sidan är anpassad för långvarig underhåll av spänning. De har ofta sarcomere längder på 10 till 15 mikrometer, tjock, vågig Z-linjer, en hög andel tunna till tjocka myofilamenten och mindre väl utvecklade system för T-tubuli och sarkoplasmatiska nätmagen. Tonic muskelfiber membran är ofta elektriskt inexcitable, eller de kan ge graderas elektriska svar ("graderas spikar"). Ett brett utbud av mellanliggande fibertyper finns i kräftdjur musklerna. 2) Ekvationer Ekvationer som vanligtvis används för att bestämma balansen potentialen hos en jon och vila membranpotential är Nernsts ekvation och Goldman-Hodgkin-Katz (GHK) ekvation respektive. En viktig skillnad mellan de två ekvationerna är att Nernsts ekvation används endast för en specifik jon att bestämma jämvikt potential för att jon, medan GHK ekvation används för att bestämma vilopotential genom att överväga att permeabiliteten av flera joner och deras gradienter över ett cellmembran (Nernsts, 1888, 1889, Goldman, 1943; Hodgkin och Huxley, 1952; Hodgkin et al, 1952;. Hodgkin och Katz, 1949, se Hille, 1992). Nernsts ekvation anses allmänt för joner över ett membran som genererar en elektrisk spänning som ofta visas som: V = (RT / ZF) ln ([X] ut / [X] i) X = ion av intresse V = jämvikt spänning för X jon över membranet R = gaskonstanten [8,314 J / (mol • K)] T = absolut temperatur [Kelvin] Z = valens av jon F = Faradays konstant [9,649 x 10 4 C / mol] För K + jon vid 20 ° C och omvandlingen av Ln att logga 10 tillsammans med att fylla i konstanterna, kommer man till: Potentiella = 58 log ([K] / [K ut]), uttryckt i mV Låt oss anta att det bara K + är permeant genom diffusion. [K i] är K + koncentration på insidan av cellen och [K ut] är K + koncentrationen på utsidan av cellen. Som en övning uppskattning [K i]. ______________ Antag för denna beräkning är membranpotential enbart beroende av K + jämvikt potential. Med tanke på [K ut] = för den använda saltlösning är 5,4 mm. Dessutom antar membranpotential är-70mV. Potentiella = 58 log ([K] / 5,4). I experimentet kommer vi att mäta en cells vila membran potential och bestämma hur den påverkas genom att förändra [K ut]. Lutningen på den hypotetiska linjen om membran potential och [K ut] är 58. Efter insamling av data om den vilande membranpotential på olika [K ut] (varierar från 5,4 mm till 100 mm) kommer vi att rita de observerade värdena för att avgöra om det är en match med den hypotetiska linje. Vi kommer att använda den genomsnittliga vila membranpotential erhållas från 5,4 mm [K ut] för att initiera den hypotetiska och observerade linjer för jämförelse. Med tanke på att ett membran kan vara genomsläpplig för mer än en jon i vila, samt vid olika depolarized stater, använder en av GHK ekvation för att ta hänsyn till permeabiliteten (P i ekvationen) för olika joner. Den GHK ekvationen kommer att minska till Nernsts ekvation om ett membran släpper igenom endast en jon. Här är en generaliserad GHK ekvation för Na +, K + och Cl – joner: Sedan Cl – har en negativ laddning, är koncentrationen termen inverterade i denna ekvation för insidan och utsidan. Detta gör att Z (jon avgift) skall falla bort. 3) Mål av denna övning I detta experiment kommer vi att mäta membranpotential av en kräfta muskelcellen och tillämpa de principer som diskuteras ovan för adress: Hur man mäter en potentiell cellmembran med lämplig instrumentering och teknik. Ion permeabilitet muskeln cellmembranet och hur det bidrar till membranpotential. Dessutom kommer vi att göra en förstudie av muskel struktur: Använd fläckar för att markera anatomi musklerna i rygg aspekt av kräftor buken, som används för att utföra dessa elektrofysiologiska experiment. Undersök histologi av olika typer muskelfibrer. I denna laboration kommer vi att använda kräftorna buken extensor muskler. Detta preparat har använts tidigare för att undervisa dessa principer i fysiologi end anatomi (Atwood och Parnas, 1968). Vi har använt många av de förfaranden från denna källa och modifierade andra för att tillgodose nuvarande instrument och att fullfölja de mål i en enda 3-timmars studerande laboratorium period. Dessa övningar är en grund för andra experiment som används i djurfysiologi kurs vid institutionen för biologi vid University of Kentucky (Instructor Dr RL Cooper, 2010). 4) Varför denna modell djur Det finns flera goda skäl för att använda kräftor buken extensor muskler i det här experimentet: Kräftor är allmänt tillgängliga och är relativt billig och lätt att underhålla i laboratoriemiljö. Den dissektion är relativt lätt för studenter att lära dissektion tekniker för live förberedelser. Muskeln är stabilt i flera timmar i en minimal fysiologisk koksaltlösning som fungerar bra för eleverna att lära elektrofysiologiska tekniker. Muskeln preparatet är ganska robust när extern [K +] ändras under korta tidsperioder. Olika synaptiska svar lätt kan erhållas genom att stimulera motoriska nervceller. Den anatomiska placeringen av extensor muskler är lätt att urskilja, och på grund av sin storlek är det relativt lätt att få stabila intracellulära inspelningar. De muskler och innervationen mönster kan observeras enkelt med metylenblått färgning. Dessutom kan viss muskel fibertyper vara lätt behandlas för histologi att observera sarcomere struktur. Inget djur protokoll behövs vid denna tid för ryggradslösa djur beredningar i laboratorieexperiment i många institutioner inom USA. 2. Metoder 1) Material Saxar (1) Pincett (1) Silvertråd för jordledning (1) Mikroskop (1) Elektrod Probe (1) Petriskål med Sylgard på botten (1) Koksaltlösning (1) Kalium Solutions: 5.4mm (fysiologisk koksaltlösning), 10, 20, 40, 80, 100 mm Bleach (liten mängd, användning för toppen av silvertråd att bygga Ag-Cl) Glaspipett (1), ta bort och lägga till lösningar Spruta (1) Förstärkare / Förvärv System (1) Faradays bur (1) Desktop / Laptop (1) Dissection stift (4) Kräftor 2) Metoder 2,1) Förberedelse / Dissection: En kräfta cirka 6-10 cm i kroppslängd bör erhållas (eller en hanterbar storlek). Håll kräftor på baksidan av huvudet eller ungefär en centimeter från baksidan av ögonen. Se till att klorna av kräftor eller munnen inte kan nå den enskilde hanterar kräftor. (Kräftorna kan placeras i krossad is i 5 minuter att söva den före skära av huvudet.) Använd den stora saxen att snabbt ta bort huvudet. Gör en ren och snabb klipp från bakom ögonen på kräftor. Kasta huvudet och bihang. Figur 1. Bilden visar placering av snittet för att ta bort huvudet av kräftor. I ben och klor av kräftor kan avlägsnas i detta skede för att undvika skador. Stylets på hanar och swimmerets på både hanar och honor kan även tas bort (Figur 2). Nästa, separat buken från bröstkorgen. Gör ett snitt längs med ledade membran som går med i buk och thorax (figur 3). Spara buken delen av kräftor och avyttra bröstkorgen. Figur 2. Saxen skär den stylets. Dessa kan tas bort från kräftor. Figur 3. Bilden visar placeringen av snittet för att ta bort bröstkorgen från buken. Figur 4. Borttagning av bröstkorgen från buken. Snittet bör göras i runda sätt längs linjen i sammanfogning av segmenten. Figur 5. Den översta bilden visar buken med swimmeret bihang. Nedre bilden visar buken utan swimmeret bihang. Med buken, bör en minskning ske i skalet längs undre, sido-gräns på varje sida av buken. Försiktighet bör iakttas att inte skära för djupt i kräftor. Att hjälpa till i arbetet med att minska skalet ska skära göras med saxen pekande förolämpa ner mot ventrala sidan och i vinkel. Följ den naturliga skal mönster av linjer kräftor som kör längden av varje segment (Figur 6). <br/> Figur 6. Saxar placeras i vinkel och följ den naturliga anpassningen av skalet. Klipp inte för djupt och förstöra förberedelserna. Den pilar pekar på den naturliga linjen längs varje segment som bör följas för nedskärningar. Ta bort den ventrala delen av skalet. Se till att inte förstöra magmusklerna. Använd pincett för att ta bort den ventrala delen. När den ventrala delen av skalet tas bort kan en vit massa av vävnad ses på toppen av den djupa Flexor muskler. Denna vävnad kan tas bort försiktigt med pincett. Figur 7. Ta bort den ventrala delen av skal med pincett. Dra upp och tillbaka på den ventrala delen att ta bort. Förstör inte musklerna under ventrala skalet. Figur 8. Dra tillbaka på den ventrala delen av skalet som ska kasseras. Figur 9. Skär den ventrala delen av preparatet med sax och kasta. Mag-tarmkanalen, ett litet rör som löper längs mittlinjen av den djupa Flexor muskler, kan tas bort från kräftor. Nyp upp i tarmkanalen med pincett och dra bort från buken. Skär ner på tarmkanalen – i slutet av svansen. Skölj dissekering med koksaltlösning för att säkerställa fekal avfallet inte störa förberedelserna. Figur 10. Bilden visar avlägsnande av mag-tarmkanalen från beredningen. Använd dissekering stift för att säkra förberedelserna till petriskål. De övre och nedre hörn av preparatet bör nålas ner i skålen. Koksaltlösning bör hällas i petriskål och omfatta förberedelse helt förrän intracellulära inspelningar utförs. Denna dissektion maträtt bör ha en Sylgard (Dow Corning) beläggning på undersidan (1 cm tjock) så att insekten stift kan fastna i den. Dissekerade förberedelser badar i vanliga kräftor saltlösning, modifierad från Van Harreveld lösning (1936), som är gjord med 205 NaCl, 5.3KCl, 13,5 CaCl 2, 2H 2 O, 2,45 MgCl 2, 6H 2 O, 5 HEPES och justeras till pH 7,4 (i mm). 2,2) Intracellulär inspelning Figur 11. Övergripande inställning i färdskrivaren. Den petriskål med beredningen bör placeras under mikroskop och säkras med vax i botten av skålen för att förhindra rörelser. Figur 12. Placering av preparatet i mikroskop. Använd vax för att säkra petriskål och förberedelse. Två kablar med vardera en kort längd av silvertråd fäst ena änden bör erhållas. Den silvertråd ska doppas i en liten mängd blekmedel i ca 20 minuter att få en Ag-Cl beläggning. Tvätta tråd med vatten innan du använder. Ett glas intracellulära pipett ska inhämtas och försiktigt återfylls med en lång nål fäst vid en spruta fylld med en 3M KCl lösning. Pipetten bör avslås (med öppningen mot golvet) och fylld med lösningen. Detta kommer att säkerställa att eventuella överskott KCl kommer att rinna ut på baksidan av elektroden. Var säker på att ingen KCl löper längs glaspipett som kommer in i saltlösning bad. Vänd pipetten upprätt när den är klar att fylla med kaliumkloridlösning. Den silvertråd kan sedan placeras i pipetten. Den andra änden är ansluten till + (positiv) polen på förstärkaren huvudet scenen. Pipetten är då säkrad på elektroden sonden. Försiktighet bör inte bryta elektroden spetsen. En tredje tråd fäst vid Faradays bur bör placeras i den gröna stolpen av huvudet scenen. Slutligen Ag tråd av resterande bly bör placeras i badet och den andra änden ansluten till – (negativ) polen visas nedan. En tråd bör också placeras på Faradays bur till marken del av AD-omvandlare Powerlab. Huvudet skede är ansluten till "input-probe" på förvärv / förstärkare (Powerlab). Figur 13. Chef skede konfiguration. Tråden är ansluten till den gröna ingången av huvudet scenen är jordad till förstärkaren eller Faradays bur. Tråden anslutas till den röda ingången är kopplad till elektroden tråd. Den svarta ingång används för att ansluta till bad lösning. Figur 14. "Test växla" är i den nedersta raden att testa elektrod resistance.The "grov"-ratten också återfinnsi DC-offset som bör omvandlas motsols. Gain är satt till 50, vilket förstärker signaler med en faktor av femtio. Marken tråd från huvudet scenen placeras i "GND" pin uttaget öppning. Den LabChart programvara bör öppnas på skrivbordet eller bärbar dator. Justera diagrammet för att bara visa en kanal genom att klicka på "Inställningar" och sedan "Kanalinställningar". Under "Kanalinställningar", ändra antal kanaler till en. Klicka på "OK". På toppen av tabellen, vänstra hörnet, bör cykler per sekund vara 2K. Ställ volt (y-axel) till ca 200mV till 500 mV. Klicka på "Kanal 1" på den högra delen av skärmen. Klicka på "Input förstärkare." Se till att Differential är markerad. Förstärkaren Produktionen skall i kanal ett. Följande inställningar ska användas med förstärkaren: High Pass-DC Notchfilter-OFF Low Pass-20kHz Kapacitet Comp .- moturs DC Offset Fin och kurs knopp-moturs DC Offset (+ OFF-) – OFF Gainratten-50 Ingång (DIFF MONO GND) – DIFF MODE (STIM-GATE-REC) – REC ΩTEST-OFF Som ett mått på elektroden motstånd, bör spänningen delas av den nuvarande, vilket är 2,0 nA (dvs R = V / I, eller Ohms lag). Det resulterande värdet är motståndet i glaselektrod. Motståndet bör vara 20 till 60 MegaOhms. Lägre (<20) och hög resistens (> 100) är inte acceptabelt. När motståndet har bestämts, kan intracellulära inspelningar börja. Placera toppen av glaset elektroden i saltlösning bad. Se till att en jordkabel är även i saltlösning badet. Till att börja inspelningen, tryck på start längst ner på skärmen. Se till att förstärkningen är satt till 5 V / div. Använd kursen ratten på förstärkaren för att flytta linjen på LabChart till noll innan du sätter elektroden. Det växla ratten ska vridas på och sedan stänga flera gånger för att testa elektroden motstånd. Därefter bör amplituden av den resulterande värden skall mätas. Placera en markör på den stadiga baslinjen och sedan placera den andra på topp för att få elektroden motstånd. Använd elektrod sond och mikroskop för att sätta in elektroden i den längsgående muskler (mark eller DEL1 eller DEL2) av preparatet (se diagram 16). Elektroden bör knappt sättas in i muskeln. Inte tränga igenom muskeln. Använd mikroskop och inställningar sond för att hitta de längsgående muskler och att sätta elektroderna i en muskel. Den höga intensiteten belysningen ska anpassas till tydligt se de muskler som elektrod förs in. När peta muskelfibrer i denna beredning kan man ofta stöter på utrymmen och klyftor i muskeln. Detta är anledningen till att membranpotential kan dyka upp, sedan försvinner sedan igen. Figur 15. Införande av elektroden i muskeln. För att mäta membranpotential, använd grova ratten på förstärkaren för att flytta linjen på LabChart till noll innan du sätter elektroden. Peta en muskelfiber. Därefter mäta amplituden av den resulterande värdena. Placera en markör på den stadiga baslinjen och registrera mätvärdet. Skillnaden i markör och den aktiva markören visas på höger sida av skärmen. Värdet ger spänning. De inspelade spänning kan behöva divideras med den mängd förstärkning används på förstärkaren (dvs 10x och 100x förstärkning). Spänningen bör omvandlas från volt till millivolt (1 V = 1000 mV) om värdena redovisas på programvaran som volt. Försiktigt använda mikroskop och manipulatorer för att ta bort elektroden från muskeln. Poke annan muskelfiber och notera vila membranpotential. Man bör ta flera inspelningar och vara bekväm med åtgärder samt styra intercellulära elektroden i muskelfibrer av intresse. Elektroden förmodligen inte kommer att bo i en muskelfiber under byte av alla de olika ändrats [K +] ut lösningar. Det är bäst att dra tillbaka elektroden, ändra sedan lösningen, då tränger igen för att undvika skador på muskeln. Det bästa är att få tre avläsningar per lösning från olika muskelfibrer och använda ett genomsnitt för att undvika falska avläsningar. Använd en spruta för att ta bort och kasta saltlösning från petriskål. Petriskålen bör fyllas med nästa högre koncentration av kaliumklorid saltlösning, som omfattar förberedelse helt. Samma process upprepas med varje Kalium och förändringarna i spänning / potential bör noteras och registreras. Den serie av [K +] ut kräftor saltlösningar vi använder är: 5,4, 20, 40, 60, 80, 100 mm. 2,3) Anatomi Nu när fysiologi är klar kan vi undersöka de tillhörandeanatomi av muskelfibrer och innervation mönster. Överför förberedelse till färgning skålen och tillsätt metylenblått (1 gram metylenblått blandas med 100 ml kräftor koksaltlösning). Låt saltlösning bada förberedelse i 5 minuter och sedan ta bort och lägga till färska kräftor koksaltlösning utan fläcken. Anatomi dessa muskler har beskrivits i detalj över åren (Huxley, 1880, Pilgrim och Wiersma, 1963). Först nyligen har några av de muskler som har beskrivits anatomiskt, fysiologiskt och biokemiskt (et al Cooper, 1998;. Griffis et al, 2000;. Sohn et al, 2000.). Den allmänna anatomiska utformning av musklerna visas i Figur 16 (höger siffra för detta ändamål). Leta efter de viktigaste nerv som innerverar främst musklerna inom ett segment. Skissa innervation mönster till SEM, DEL2, DEL1 och mark muskler i ett segment. Buken behöver sträckas ut helt genom att fästa beredningen i skålen ordentligt. Nästa bort salt och tillsätt Fixeringslösning. Den fixa lösningen är en Bouins lösningen (beredd med mättade pikrinsyra, formaldehyd och ättiksyra, Sigma-Aldrich Co). VARNING. Bli inte denna lösning på huden eller i ögonen. Undvik ångorna av lösningen genom att arbeta under dragskåp. Om dina ögon börjar brinna tvätta ögonen omedelbart vid ögonspolning. Låt Bouins lösning kvar på förberedelserna i ca 10 minuter och sedan använda en pipett och utbyte lösningen för koksaltlösning. Skär en tunn bit DEL1 eller DEL2 muskler ut och placera på en glasplatta. Märk bilden. Upprepa proceduren för SEM muskeln. Visa sarcomere ränder mönster i såväl mjukpapper beredningar. Du kan använda det sammansatta mikroskopet och justera målen därför att se ränder mönster. Om möjligt ta ett digitalfoto genom ögat-bit av mikroskop (OBS! Vissa mobiltelefon kameror fungerar bra för detta förfarande). Figur 16. Schematisk ritning från en ventral bild av ryggdelen av kräftor buken visar extensor muskulatur i varje segment. Den dorsala membran buken muskler (DMA) och ytliga extensor tillbehöret muskel huvudet (SEAcc) förekommer i segment 1 till 5 av buken med en annan inriktning för varje segment. Med undantag av del 1, dessa muskler har sin infästning webbplatser på deras främre änden till förkalkad tergite och vid den bakre änden i artikulära membran. I del 1, homolog muskler har sina främre infästning platser till artikulär membranet ligger mellan bröstkorgen och buken. Bilden var baserad på fotografiska montage metylenblått färgade preparat. På den vänstra sidan av figuren alla djupa extensor muskler har tagits bort för att visa rygg ytliga extensor muskler. Skala = 2,35 mm. (Utdrag ur Sohn et al. 2000). 3. Resultat Följande frågor och databehandling illustrera de viktigaste principerna och målen för detta laboratorium förfarande. Plotta de åtgärder som erhålls för vila membran potential i varje [K +] ut används. Se om det observerade och hypotetiska linjer matchas i sin sluttning. För att rita värdena använda en semi-log tomt med x-axeln av varierande [K +] ut som en stock och y-axeln av membranet potentialer (enligt nedan, Figur 17). (Ladda ner gratis rutat papper om det behövs http://incompetech.com/graphpaper/logarithmic/ ) Figur 17. Rutat papper Använd den genomsnittliga vila membranpotential erhållas från 5,4 mm [K +] ut för att inleda hypotetiska och observerade linjer för jämförelse. Om linjerna inte stämmer överens diskutera varför detta kan vara. Om du ändrat den externa nivån av Na + joner, skulle du förvänta dig samma typ av förändringar som observerats för byte av K + koncentration? Hur väl har metylenblått fläcken musklerna jämfört med nerverna? Varför kan det finnas skillnader? Är metylenblått som idag används för identifiering av vävnader eller kontrast i levande mänskliga celler? Vilken relation är där med Sigmund Freud och fläckar används i kräftor? Notera eventuella skillnader i sarcomere mönster mellan DEL och SEM muskler. Om så är fallet, vad kan vara orsaken? Har alla muskler har samma vilande sarcomere avstånd? Rita muskeln banding mönstret du observerats med mikroskop och etikett så mycket av bilden som möjligt (i förhållande till kända sarcomere muskler anatomi). 4. Mätning Synaptic Responses 1) INLEDNING Buken extensor muskler preparat som används för att demonstrera vila membranpotential är också idealisk för att visa induktion av synaptiska svar på NMJs från de olika musklerna. Vissa muskler i kräftdjur selektivt innerveras av antingen en phasic eller en tonic motorneuron, även om vissa enstaka fibrer kan innerveras av både phasic och tonic excitatoriska motoriska nervceller, till exempel för extensor muskulatur i kräftor gå ben (Atwood, 2008, se JUPITER produktion ID # 2319-Wu och Cooper, 2010) och de flesta andra muskler lem (Wiersma, 1961 a). Genom att selektivt stimulera phasic och tonic motoriska nervceller kan fysiologiska skillnader i EPSPS mätas. Phasic motoriska nervceller producerar snabba ryckningar i muskelfibrer och framkalla EPSPS på order av 10-40 mV. Den phasic svar kan sänka snabbt med 5-10-Hz tåg av stimulering. Den tonic motoriska nervceller ger upphov till mindre EPSPS som kan underlättas i närvaro av en högre frekvens (10-50 Hz) av stimulering. Strukturellt, det presynaptiska phasic och tonic terminaler vid NMJs är olika (Atwood och Cooper, 1996; Bradacs et al, 1997;.. Cooper et al, 1998). Överraskande fenotypen av phasic fysiologiska reaktioner kan genomgå en omvandling till en tonic-liknande tillstånd med elektriskt konditionering phasic nervceller i ett par timmar dagligen under 7 dagar (Cooper et al, 1998;. Mercier och Atwood, 1989). Även känsligheten för neuromodulering i förvandlas NMJs är utmärkt för att undersöka regleringen av receptorer (Griffis et al., 2000). I denna relativt robusta förberedelse (kräftor magmuskler), är båda tonic och phasic svar enkelt registreras och undersökas för att underlätta och / eller depression av synaptiska svar med varierande stimulans paradigm. Med dessa förberedelser kommer studenterna kunna känna igen allmänna ordalag om phasic och tonic synaptiska svar genom att stimulera en nerv bunt. En ytterligare NMJ förberedelse presenteras används för övervakning inneboende motorisk aktivitet och sinnesretning inducerade motorisk aktivitet från CNS. Detta är den ytliga flexor musklerna på den ventrala sidan av kräftor buken. Denna förberedelse kommer också att användas för att övervaka sensoriska-CNS-motor-muskel krets och effekterna av neuromodulators (Strawn et al., 2000). I varje buken segment (utom den sista) Det finns tre funktionella grupper av muskler: (1) de som kontrollerar pleopod (swimmerets) rörelse, (2) tre extensor muskler och (3) tre muskler flexor. Den flexors och extensorer är antagonistiska muskelgrupper som medför antingen buken flexion eller förlängning genom att orsaka rotation om intersegmental gångjärn. Den phasic muskulatur upptar större delen av volymen av buken, medan toniska musklerna består tunna blad av fibrer som spänner över rygg (extensorer) och ventrala (flexors) aspekt av varje buken segment. I kräftor, är de tonic buken flexor musklerna kräftor innerveras i varje halva segment av fem motoneurons och genom en perifer hämmande neuron. Den excitatoriska motoneurons använder glutamat som signalsubstans. Glutamat depolarizes muskelfibrer genom att orsaka en ökning av permeabilitet främst natriumjoner. Den hämmande nervceller ut gamma-amino smörsyra (GABA), som vanligtvis hyperpolarizes muskelfibrer genom att orsaka en ökad permeabilitet för kloridjoner. I vissa kräftdjur muskler (främst i benen), den perifera hämmande nervceller göra synaptiska kontakter med motorneuron terminaler samt med muskelfibrer och minska mängden sändare släpptes av motor neuron (presynaptisk hämning) (Dudel och Kuffler, 1961 ). Detta fenomen är inte närvarande i tonic flexor musklerna av kräftor. Den ventrala nerv ur kräftor är ett bilateralt symmetrisk struktur kör längden på djuret. Det finns ett ganglion per kropp segment. I buken (6 segment), innehåller varje ganglion flera hundra neuroner, och varje av de två konnektiv består av några tusen axoner. Nervcellen kroppar bildar ett lager flera cell organ tjockt på den ventrala ytan på varje ganglion. Omedelbart ovanför cellkroppen lagret är en fin meshwork av neuronala processer, neuropile. Alla synaptiska interaktioner inträffa här, cellens organ saknar synapser. Varje buken ganglion (utom den sista) har tre rötter på varje sida. Den första roten innehåller axoner av nervceller innervating de pleopod muskulatur och sensoriska axoner, den andra roten innehåller axoner innervating phasic och tonic extensor muskulatur och sensoriska axoner, och den tredje roten, vilket gör att nerven sladden flera millimeter caudal till ganglion, innehåller axoner innervating phasic och tonic flexor muskulatur. Det finns två grenar av den tredje roten. Den djupa grenen (IIIa) innerverar bara phasic flexor musklerna. Den ytliga grenen av den tredje roten (III b) i varje halv-segmentet innehåller sex axoner som innerverar tonic flexor musklerna. Nervceller innervating de tonic flexor är spontant aktiva, till skillnad från phasic efferent nervceller, och i en bra förberedelse, kommer de att fortsätta att skjuta i många timmar efter att buken har tagits bort från djuret. För en översikt av den historiska karaktären av de upptäckter som gjorts i dessa buken förberedelser se Atwood (2008). Cellen organ fyra av de motoriska nervceller och perifera inhibitoriska neuron innervating de tonic flexor musklerna på något halv segment finns i ganglion i detta segment. Cellkroppen av den återstående motor neuron ligger i nästa caudal ganglion. Dessa nervceller kan tillförlitligt särskiljas från varandra på grundval av extracelluarly inspelade spik amplituder. Om tonic flexor muskler från en halv segment tas bort tillsammans med de två ganglier som innehåller de nervceller innervating denna muskel, fem nervceller brukar visa en viss grad av spontan aktivitet. Dessa nervceller är numrerade på grundval av relativa extracellulärt spik amplitud, i stigande ordning. F1 till F4 är motoneurons och F5, den största spontant aktiva neuron, är den perifera flexor-hämmare. F6, den största motor neuron, är en excitatoriska motorneuron som sällan spontant aktiv. Den spontana natur tonic motorneuron aktivitet kan moduleras av exogena tillämpning av föreningar eller genom att ge en sensorisk stimulans för nagelbanden inom samma segment som övervakas för motor nervaktivitet. 2) Dissection För att få buken extensor beredningen samma procedur som beskrivs ovan för att pröva vilande membranet potentialen i förhållande till extracellulära kalium. Skillnaden är att ta hand om segmentell nervknippen som löper längs sidan av ryggskölden. Denna nerv kommer att dras in i ett sug elektrod som kommer att fungera som stimulerande elektrod. Stimulera vid 1 Hz för övervakning phasic svar. Stimulera med korta skurar av pulser 10Hz i 10 till 20 stimuli medan du övervakar tonic svar. Det experimentella förfaranden för vård experiment på flexor kräftor tonic muskler är olika och man måste lämna ventrala nerven sladden intakt. Ett preparat som består av flera buken segment görs. Detta erhålls på följande sätt: En kräfta cirka 6-10 cm i kroppslängd bör erhållas (eller en hanterbar storlek). Skaffa kräftor genom att hålla den från baksidan av huvudet eller ungefär 2 eller 3 centimeter från baksidan av ögonen. Se till att klorna av kräftor eller munnen inte kan nå försöksledaren vid hantering av kräftor. Kasta huvudet och bihang först ta bort dem. Använd sax för att snabbt ta bort huvudet. Gör en ren och snabb klipp från bakom ögonen på kräftor. Figur 18. Bilden visar placering av snittet för att ta bort huvudet av kräftor. I ben och klor av kräftor kan avlägsnas i detta skede för att undvika skador. Stylets på hanar och swimmerets på både hanar och honor kan även tas bort (Figur 19 och 20). Nästa, separat buken från bröstkorgen. Gör ett snitt längs med ledade membran som går med i buk och thorax (figur 20). Spara buken delen av kräftor och avyttra bröstkorgen. Figur 19. Bilden visar placeringen av stylets som kan tas bort från kräftor. Figur 20. Bilden visar placeringen av snittet för att ta bort bröstkorgen från buken. Figur 21. Borttagning av bröstkorgen från buken. Snittet bör göras i runda sätt längs linjen för sammanfogning av segmenten. Figur 22. Den översta bilden visar buken med bihang. Nedre bilden visar borttagning av buken bihang. Placera den isolerade svansen beredningen i saltlösning i en stor petriskål. Pin ner svansen och övre delen av preparatet i skålen. Se till att beredningen är säker. Använd en skalpell för att ta bort en kvadrat del av den ventrala sidan av förberedelserna mellan revbenen. Figur 23.Visar var snittet ska göras för att ta bort den ventrala dryck av preparatet. En liten skär bör göras (kan också göras med sax). En flik ska klippas och lyfts uppåt. Luckan kan sedan tas bort med en sax, utsätta de djupa flexor musklerna. Mikroskopet bör användas under denna process för att säkerställa precision i att ta bort ventrala delen av preparatet. Figur 24. Skärning förberedelser med sax för att exponera muskler. Figur 25. Översta bilden visar att greppa i luckan med pincett. Nedre bilden visar bort luckan från förberedelserna med mikroskop. Figur 26. Exponering av ytliga Flexor muskler. 3) Intracellulär inspelning: Figur 27. Övergripande inställning i färdskrivaren. Den petriskål med beredningen bör placeras under mikroskop och säkras med vax i botten av skålen för att förhindra rörelser. Figur 28. Visar placering av preparatet i mikroskop. Använd vax för att säkra petriskål och förberedelse. Två kablar med korta längd av silver fäst vid ena änden bör erhållas. Den silvertråd ska doppas i en liten mängd blekmedel i ca 20 minuter att få en Ag-Cl beläggning. Tvätta tråd med vatten innan du använder. Ett glas intracellulära pipett ska inhämtas och försiktigt fylld med en KCl (3 M) lösning. Pipetten bör avslås (med öppningen mot golvet) och fylld med lösningen. Den senare kommer att säkerställa att eventuella överskott KCl kommer att droppa ut på baksidan av elektroden. Var säker på att ingen KCl löper längs glaspipett som kommer in i saltlösning bad. Vänd pipetten upprätt när den är klar att fylla med kaliumkloridlösning. Den silvertråd kan sedan placeras i pipetten. Den andra änden är ansluten till + (positiv) polen på huvudet scenen. Pipetten är då säkrad på elektroden sonden. Försiktighet bör inte bryta elektroden pipetten. En tredje tråd fäst vid Faradays bur bör placeras i den gröna stolpen av huvudet scenen. Slutligen Ag tråd av resterande bly bör placeras i badet och den andra änden ansluten till – (negativ) polen visas nedan. En tråd bör också placeras på Faradays bur till marken del av AD-omvandlare Powerlab. Huvudet steget är ansluten till "input-probe" på förvärv / förstärkare (Powerlab). Figur 29. Chef skede konfiguration. Tråden är ansluten till den gröna delen av huvudet scenen är jordad till förstärkaren eller Faradays bur. Tråden anslutas till den röda delen är kopplad till elektroden tråd. Den svarta delen används för att ansluta till bad lösning. Figur 30. "Test växla" är i den nedersta raden att testa elektrod motstånd. Den "grova" knoppen är också hittas under DC-offset som bör omvandlas motsols. Gain är satt till 50, vilket förstärker signaler med en faktor av femtio. Marken tråd från huvudet scenen placeras i "GND" pin uttaget öppning. Den LabChart programvara bör öppnas på skrivbordet eller bärbar dator. Justera diagrammet för att bara visa en kanal genom att klicka på "Inställningar" och sedan "Kanalinställningar". Under "Kanalinställningar", ändra antal kanaler till en. Klicka på "OK". På toppen av tabellen, vänstra hörnet, bör cykler per sekund vara 2K. Ställ volt (y-axel) till ca 200mV till 500 mV. Klicka på "Kanal 1" på den högra delen av skärmen. Klicka på "Input förstärkare." Se till att Differential är markerad. Förstärkaren Produktionen skall i kanal ett. Följande inställningar ska användas med förstärkaren: High Pass-DC Notchfilter-OFF Low Pass-20kHz Kapacitet Comp .- moturs DC Offset Fin och kurs knopp-moturs DC Offset (+ OFF-) – OFF Gainratten-50 Ingång (DIFF MONO GND) – DIFF MODE (STIM-GATE-REC) – REC ΩTEST-OFF För att mäta elektroden motstånd, bör spänningen delas av den nuvarande, vilket är 2,0 NA. Det resulterande värdet är motståndet i glaselektrod. Motståndet bör vara 20 till 60 MegaOhms. När motståndet har bestämts, kan intracellulära inspelningar börja. Placera toppen av glaset elektroden i saltvatten badet. Se till att en jordkabel är även i saltlösning badet. Till att börja inspelningen, tryck på "start" längst ner på skärmen. Se till att förstärkningen är satt till 5 V / div. Använd kursen ratten på förstärkaren för att flytta linjen på LabChart till noll innan du sätter elektroden. Det växla ratten ska vridas på och sedan stänga flera gånger för att testa elektroden motstånd. Därefter bör amplituden av den resulterande värden skall mätas. Placera en tillverkare den stadiga baslinjen och sedan placera den andra på topp för att få elektroden motstånd. Använd elektrod sond och mikroskop för att sätta in elektroden i en muskel. Inte tränga igenom muskeln. Använd mikroskop och inställningar sond för att hitta det tunna lagret av muskelfibrer och att sätta elektroderna i fibrerna. Den höga intensiteten belysningen kan användas som en ljuskälla då tränga in i muskeln. Figur 31. Införande av elektroden i muskeln. Försiktighet måste vidtas för att undvika skador på nervrötter i ytliga muskler. Det är lämpligt att hålla saltlösning bad förberedelserna svalt (10-15 grader) och väl syresatt vid utförandet av den experimentella procedurer. Om kylaggregat finns inte ersätta saltlösning med färsk, kyld saltlösning regelbundet. Syrgas, eller åtminstone luften bör bubblas genom koksaltlösning. Anteckna spontana aktivitet EPSPS. Notera de olika storlekarna av EPSPS och om IPSPs är närvarande. Mycket noga att ta en liten färg buske och för hand stimulera längs nagelbanden kanten inom samma segment som en följer den spontana aktiviteten. Notera en förändring i frekvensen av svaren och om olika storlek EPSPS verkar som inte fanns före stimulera nagelbanden. Figur 32. Beredningar stimulerande pensel och nervrötter. (Modifierad från Strawn et al., 2000) Stimuleringen kan upprepas efter noggrant byta ut saltlösning bad med en som innehåller en neuromodulator som serotonin (1 microM) eller saltlösning bubblade med CO 2. Notera effekt på aktiviteten profilen för en viss stimulans. Notera också om utbyte av koksaltlösning tillbaka till färsk koksaltlösning återgår verksamheten till dess ursprungliga skick. Därefter kan man följa neural aktivitet i sensoriska-CNS-motorneuron krets på olika sätt. Vi kan använda en sug elektrod i stället för en intracellulär elektrod (Figur 33) för att övervaka motorneuron aktivitet. På toppen av glaset sug elektroden är plaströr placeras som har en öppning av rätt storlek för att dra nerven i spetsen. Öppningen bör inte vara för stor, eftersom nerven skulle falla ut, eller för liten, eftersom nerven skulle skadas av trycket från elektroden. Den plastslang dras över en låga och trimmat tillbaka till krävs storlek. Figur 33. Installera med sug elektrod inspelning arrangemang. Placera mikromanipulator i en position där sug-elektroden har enkel tillgång till salta bad. Sug upp koksaltlösning tills den är i kontakt med silver inuti sug elektroden. Ordna den andra kabeln på cut-sidan av sug elektrod nära spetsen av elektroden, så båda ledningarna kommer i kontakt med koksaltlösning badet. När det gäller elektriska övervakning anslut AC / DC differentialförstärkare (förstärkare) till 26T Ström Lab. Gör detta genom att ansluta den rätta kabeln från ingång 1 på PowerLab 26T till utgången på förstärkaren. Förstärkaren instrumentet kontroller bör sättas till följande inställningar: High Pass-DC Notchfilter-OFF Low Pass-20kHz Kapacitet Comp .- moturs DC Offset Fin och kurs knopp-moturs DC Offset (+ OFF-) – OFF Gainratten-50 Ingång (DIFF MONO GND) – DIFF MODE (STIM-GATE-REC) – REC ΩTEST-OFF Anslut huvudet scenen till "input-sond" på förstärkaren. Anslut den elektriska kablarna från sug elektroden till huvudet scenen. Ledningarna skall anslutas med den röda (positiva) längst upp till vänster, grön (jord) i mitten, svart (negativ längst ner. Detta indikeras i Figur 34. Jordledningen bara kan läggas i saltlösning badet. Figur 34. Chef skede konfiguration Nu ansluter USB-sladden från PowerLab 26T till den bärbara datorn. Kontrollera att både förstärkaren och PowerLab26T är inkopplad och påslagen innan du öppnar LabChart7 på datorn. Öppna LabChart7. Den LabChart Welcome Center ruta poppar öppna. Stänga det. </Li> Klicka på Inställningar Klicka på kanal inställningar. Ändra antal kanaler till 1 (nedre vänstra hörnet av rutan) tryck på OK. Längst upp till vänster i diagrammet anger cykler per sekund till cirka 2k. Ställ volt (y-axeln) till omkring 500 eller 200mV. Klicka på Kanal 1 till höger i diagrammet. Klicka på Input förstärkare. Se till att inställningarna: single-ended, AC kopplade, och invertera (inverterar signalen om det behövs), och anti-alias, kontrolleras. Till att börja starta inspelningen trycker på. Vi kan spela in från den gren av den 3: e roten som innerverar de ytliga flexor musklerna (filial IIIb) att övervaka storlek aktionspotentialen med extracellulära inspelning. Den extracellulära nervimpulser kallas "spikes". Minns att det finns fem Excitor motoriska nervceller och en hämmare motorneuron i roten (Kennedy och Takeda, 1965, Velez och Wyman, 1978). Stimulering av nagelbanden med en borste eller exponering av neuromodulators kan användas (Figur 35). Den pensel kan användas för hand eller för konsekvent stimulering kan det vara monterad på en mikromanipulator att kontrollera mängden av tryck och rörelse. Figur 35. Aktivitet i 3: e roten före och under cuticular stimulans i saltlösning (överst) och i 100 nM 5-HT (botten). Tiden under nagelbanden stimulering indikeras av baren. Notera ökad aktivitet före och efter stimulering då preparatet badar i 5-HT (modifierad från Strawn et al., 2000). Vi kan spela in från den 1: a eller 2 rötter a genom att göra en en passant inspelning av nerv, eller vi kan transekt roten bort från VNC och spela in rena sinnesintryck som härrör från periferin som skulle sända signaler till VNC. Således skulle du spela in från transected roten leder till periferin för sensorisk aktivitet. Den 2: a roten innehåller mycket stora primära afferenta axon från organ muskel-receptorn (MRO) och mindre axoner av efferents till extensor motoriska nervceller (Fält och Kennedy, 1965). Det finns många sensoriska axoner i 1 och 2 rötter ND. Den mechanosensory nervceller har direkta förbindelser, av elektriska synapser med laterala gigantiska axoner (LG) (Krasne 1969, Zucker 1972). Dessutom är mechanosensory nervceller kända för att excitera interneuronen via kemiska synapser. Att undersöka hur sinnesintryck kan påverka motorneuron aktivitet, genom en sensorisk-CNS-motorneuron krets, kan vi spela in synaptiska svar i en muskel. Olika aspekter av kretsen vi kommer att använda kan undersökas. Till exempel kan vi spela in från de sensoriska nervrot ensam eller motorn roten med eller utan intakt sensorisk input i VNC Att analysera spetsen frekvens inspelningar, kan man räkna med under en viss tid i olika förhållanden. Åtgärderna kan göras före borsta stimulering och under penseln stimulering för en viss tid (Figur 35). Man kan upprepa villkor 5 gånger och få den genomsnittliga procentuella förändringen i frekvens som en åtgärd för att göra jämförelser. Man kan också ansöka exogena ämnen som serotonin (Strawn et al., 2000) eller acetylkolin (ACH), nikotin eller glutamat. Olika beteendemässiga åtgärder har beskrivits för nikotin i ryggradslösa djur. Detta tyder på förekomst av nikotinreceptorer (Tsunoyama och Gojobori, 1998). Glutamat är en stor excitatoriska neurotransmittorn i de flesta ryggradslösa djur på NMJ och ACH är den viktigaste excitatoriska neurotransmittorn i CNS (Monoghan et al, 1989;. Watkins, et al, 1990). Man kan prova heptanol eller CO 2 bubblade koksaltlösning eftersom det kommer att koppla bort kräftor septate (eller gap) junctions inom kretsen som Dr Sonya M. Bierbower (University of Kentucky) har visat i sin avhandling forskning. Denna åtgärd kan stå för förändrade hela djurens beteende när de utsätts för höga CO 2 i miljön (Bierbower och Cooper, 2010). När du stimulerar nagelbanden med en borste och kör sinnesintryck och spela in ett svar i den motoriska nervceller, notera om det finns en skillnad i verksamheten före och under heptanol eller CO 2 exponering. Detta kan eller inte kan föreslå gap-junctions att ha en roll i den sensoriska-CNS-motorneuron krets.