Potenciais de membrana, Responses Synaptic, circuitos neuronais, neuromodulação e Histologia Muscle Usando a lagosta: Exercícios Laboratório Student

1. Introdução Os objetivos destes exercícios de laboratório são para compreender as propriedades das membranas excitáveis, a base iônicas do potencial de repouso da membrana, e métodos para medir o potencial de membrana. Além disso, a coloração e histologia do músculo é apresentado, o que pode ser usado para ensinar a estrutura muscular. Além disso, dois tipos diferentes de preparações dissecados são usados ​​para demonstrar as propriedades da transmissão sináptica em vários grupos musculares. Um sistema sensório-central completo nervoso central (SNC)-motor de circuito neurônio músculo no abdômen crustáceo também é usado para apresentar uma preparação para examinar a estimulação sensorial ea influência da neromodulators e neurotransmissores sobre aspectos de um circuito. A primeira parte deste relatório apresenta as abordagens utilizadas para medir o potencial de repouso da membrana ea influência do K + extracelular sobre o potencial de membrana. Vamos também apresentar estrutura muscular. Na segunda parte deste exercício, apresentamos vários meios de medir as respostas sinápticas em diferentes tipos de junções neuromusculares (NMJs). O primeiro exercício usa as lagostas músculos extensores abdominal eo segundo utiliza o abdominal músculos flexores superficial. Além disso, apresentamos um circuito neural (o cordão nervoso ventral do crustáceo com entradas sensoriais e as saídas do motor) que é fácil de manter, e que pode ser usado para o ensino, bem como para a pesquisa em vários aspectos de um CNS sensório- neurônio motor-músculo-circuito. Depois de completar a explicação dos exercícios iniciais, apresentamos a fisiologia do NMJs e circuito CNS. O gradiente de íons através de uma membrana biológica pode resultar em uma diferença de potencial. Para uma célula em repouso, essa diferença de carga elétrica através da membrana celular é conhecido como o potencial da célula de membrana em repouso. Há dois fatores principais que irá abordar essa influência potencial de uma célula de membrana. A primeira é a concentração de íons de ambos os lados da membrana. A segunda é a permeabilidade iônica da membrana. É importante ter em mente que em uma célula viva há uma série de íons diferentes, com diferentes concentrações dentro e fora da célula. Os íons-chave que irá abordar são o sódio (Na +), potássio (K +) e cloreto (Cl-). As quantidades e movimento desses íons através de uma membrana muscular determina o potencial de membrana. A partir desse fundamento, podemos abordar potenciais elétricos observados durante a excitação elétrica ea inibição de uma membrana a partir das respostas sinápticas e examinar os efeitos de agentes farmacológicos. Podemos também construir modelos biofísicos para representar esses processos aos conceitos de teste experimental (Robinson et al., 2010). O uso de microeletrodos de vidro capilar permite a gravação de potenciais de membrana. O eletrodo pode ser inserido através da membrana celular sem danos, proporcionando a ponta é suficientemente pequeno e uma medida precisa do potencial transmembrana pode ser obtida. A técnica é particularmente aplicável a grandes células, que são menos propensos a ser danificados pela inserção do eletrodo intracelular. Esta é uma das técnicas essenciais na fisiologia. O balanço de Na + e K + através da membrana é mantida pela bomba ATPase Na-K em condições fisiológicas. Em condições normais, os movimentos da bomba, em média, três Na + para fora da célula e dois K + para dentro da célula. Como uma nota lateral, um Prêmio Nobel de Química foi concedido em 1997 por esta descoberta feita novamente no final dos anos 1950. Os fundamentos da descoberta foram obtidos a partir de pesquisa utilizando os axônios de um caranguejo (Skou, 1965, 1998). Esta bomba também é considerado electrogénico, pois tem uma maior capacidade de bomba quando a membrana é despolarizada (Skou, 1989a, b). Em muitas células, a bomba acelera quando uma célula é eletricamente ativado por despolarização. De potássio também pode mover-se através de potássio "vazamento" de canais, enquanto uma célula está em um estado de repouso. Devido a esses canais de vazamento de potássio, a membrana da célula em repouso é mais permeável ao potássio do que outros íons. Assim, o potencial da célula de membrana em repouso está mais perto do potencial de equilíbrio para o potássio do que a de sódio. O potencial de repouso da membrana pode então ser analisada para ver se ele depende do potencial de equilíbrio de potássio. 1) variabilidade Muscle Fibras musculares crustáceo mostram maior variabilidade de características estruturais, propriedades da membrana elétrica e propriedades contráteis do que as fibras musculares dos vertebrados. Fibras musculares fásicas em crustáceos são modificados para twitch tipo contrações. Eles são caracterizados por curtos comprimentos de sarcômero (2-4 microns), fina, em linha reta Z-linhas, uma baixa relação de miofilamentos finos para grossos, e sistemas bem desenvolvidos de T-túbulos e sarcoplasmáticoretículo. Membranas de fibra muscular fásica podem gerar potenciais de ação classificados ou tudo ou nada. Fibras musculares tônicas, por outro lado, são modificados para a manutenção prolongada de tensão. Muitas vezes eles têm comprimentos de sarcômero de 10 a 15 microns, grosso, ondulado Z-linhas, uma alta proporção de finos para miofilamentos grossos, e sistemas menos desenvolvidos de túbulos T e retículo sarcoplasmático. Membranas de fibra muscular tônica muitas vezes são eletricamente inexcitable, ou podem produzir classificados respostas elétricas ("picos classificados"). Uma grande variedade de tipos de fibra intermediária é encontrada nos músculos crustáceo. 2) Equações Equações que são comumente usados ​​para determinar o potencial de equilíbrio de um potencial de membrana de íons e de descanso são a equação de Nernst eo Goldman-Hodgkin-Katz equação (GHK), respectivamente. Uma importante distinção entre as duas equações é que a equação de Nernst é utilizada apenas para um íon específico para determinar o potencial de equilíbrio para esse íon, enquanto que a equação GHK é usado para determinar o potencial de repouso, considerando a permeabilidade de íons de múltiplas e seus gradientes através uma membrana celular (Nernst, 1888, 1889; Goldman, 1943; Hodgkin e Huxley, 1952; Hodgkin et al, 1952;. Hodgkin e Katz, 1949; ver Hille, 1992). A equação de Nernst é geralmente considerado de íons através de uma membrana gerando uma força eletromotriz como comumente mostrado como: V = (RT / ZF) ln ([X] out / [X] in) X = íon de interesse V = tensão de equilíbrio para o íon X através da membrana R = constante dos gases [8,314 J / (mol • K)] T = temperatura absoluta [Kelvin] Z = valência do íon F = constante de Faraday [9,649 x 10 4 C / mol] Para o íon K + a 20 ° C e transformação de Ln para Log 10, juntamente com o preenchimento do constantes, chega-se a: Potencial = 58 log ([K in] / [K out]); expresso em mV Vamos supor que + K só é permeante por difusão. [K in] é a concentração de K + no interior da célula e [K out] é a concentração de K + na parte externa da célula. Como uma estimativa exercício [em K]. ______________ Assumir para este cálculo, o potencial de membrana é apenas dependente do potencial de equilíbrio K +. Dada a [K out] = para a solução salina utilizada é de 5,4 mM. Além disso, assume potencial de membrana é-70mV. Potencial = 58 log ([K in] / 5,4). No experimento iremos medir o potencial de uma célula de membrana em repouso e determinar como ela é influenciada pela alteração [K out]. A inclinação da linha hipotética relativas potencial de membrana e [K out] é de 58. Depois de coletar dados sobre o potencial de repouso da membrana em diversas [K out] (variação de 5,4 mm para 100 mm), vamos traçar os valores observados para determinar se existe uma correspondência com a linha hipotética. Nós vamos usar o potencial de membrana de repouso média obtida em 5,4 mM [K out] para iniciar as linhas hipotéticos e observados para a comparação. Considerando que uma membrana pode ser permeável a mais de um íon em repouso, bem como em vários estados despolarizada, um usa a equação GHK levar em conta a permeabilidade (P na equação) para vários íons. A equação GHK irá reduzir a equação de Nernst se uma membrana é permeável apenas um íon. Aqui é uma equação generalizada para GHK Na +, K + e Cl – íons: Desde Cl – tem uma carga negativa, o termo concentração é invertida nesta equação para o interior eo exterior. Isso permite que o Z (carga iônica) para ser deixado de fora. 3) Objectivos deste exercício Neste experimento iremos medir o potencial de membrana da célula muscular lagostas e aplicar os princípios discutidos acima para o endereço: Como medir um potencial de membrana celular com instrumentação adequada e técnica. Permeabilidade iônica da membrana da célula muscular e como ela contribui para o potencial de membrana. Além disso, faremos um estudo preliminar da estrutura muscular: Use manchas para destacar a anatomia dos músculos no aspecto dorsal do abdômen crustáceo, que é utilizado para a realização desses experimentos eletrofisiológicos. Examine a histologia de diferentes tipos de fibra muscular. Neste exercício de laboratório, usaremos o lagostim músculos extensores abdominal. Esta preparação tem sido utilizada no passado para ensinar esses princípios em fisiologia umad anatomia (Atwood e Parnas, 1968). Temos usado muitos dos procedimentos a partir desta fonte e outros modificado para acomodar a instrumentação atual e para completar os objetivos em um período de três horas de laboratório único aluno. Estes exercícios são uma base para outros experimentos utilizados no curso Fisiologia Animal do Departamento de Biologia da Universidade de Kentucky (Instrutor Dr. RL Cooper, 2010). 4) Por que este modelo animais Existem várias boas razões para usar o lagostim músculos extensores abdominal neste experimento: Lagostas são comumente disponíveis e são relativamente baratos e fáceis de manter em condições de laboratório. A dissecção é relativamente fácil para os estudantes que aprendem técnicas de dissecção para os preparativos ao vivo. O músculo é estável por várias horas em uma solução salina mínima normal, que serve bem para os estudantes que aprendem técnicas eletrofisiológicas. A preparação do músculo é bastante robusto quando externas [K +] é alterado para curtos períodos de tempo. Várias respostas sinápticas podem ser facilmente obtidos, estimulando os neurônios motores. A disposição anatômica dos músculos extensores é fácil de discernir, e devido a seu grande tamanho é relativamente fácil de se obter estabilidade gravações intracelular. Os músculos e do padrão de inervação pode ser observado facilmente com coloração de azul de metileno. Além disso, os tipos de fibras musculares em particular pode ser facilmente processados ​​para histologia para observar a estrutura do sarcômero. Nenhum protocolo de animais são necessários neste momento para preparações animais invertebrados em experimentos de laboratório em muitas instituições dentro dos EUA. 2. Métodos 1) Materiais Tesouras (1) Fórceps (1) Fio de prata para fio terra (1) Microscópio (1) Probe eletrodo (1) Petri Dish com Sylgard na parte inferior (1) Solução salina (1) Soluções de potássio: 5,4 mm (solução salina normal), 10, 20, 40, 80, 100 mM Bleach (pequena quantidade, para Use a ponta do fio de prata de construir Ag-Cl) Pipeta de vidro (1), para remover e adicionar soluções Seringa (1) Amplificador / Sistema de Aquisição (1) Faraday Cage (1) Desktop / Laptop (1) Dissecção pinos (4) Lagostim 2) Métodos 2.1) Preparação / Dissection: Um crustáceo de aproximadamente 60-10 cm de comprimento do corpo deve ser obtido (ou um tamanho gerenciável). Segure o crustáceo na parte de trás da cabeça ou aproximadamente um centímetro na parte de trás dos olhos. Garantir que as garras da lagosta ou sua boca não pode chegar o indivíduo lidar com o crustáceo. (As lagostas podem ser colocados em gelo picado por 5 minutos para anestesiar-lo antes de cortar a cabeça.) Use a tesoura grande para remover rapidamente a cabeça. Faça um corte limpo e rápido de trás dos olhos do lagostim. Dispor da cabeça e apêndices. A Figura 1. A imagem mostra a colocação do corte para remover a cabeça da lagosta. As pernas e as garras da lagosta pode ser removido neste momento para evitar ferimentos. Estiletes em machos e pleópodes em ambos os machos e fêmeas também pode ser removido (Figura 2). Em seguida, separe o abdômen do tórax. Faça um corte ao longo da membrana articular que se junta o abdômen e tórax (Figura 3). Salvar a parte do abdômen do crustáceo e dispor do tórax. Figura 2. A tesoura está cortando o estiletes. Estes podem ser removidos do lagostim. Figura 3. Imagem mostra o posicionamento da corte para remover o tórax do abdômen. Figura 4. Remoção do tórax do abdômen. O corte deve ser feito em forma circular ao longo da linha na união dos segmentos. Figura 5. A imagem acima mostra o abdômen com apêndices swimmeret. Imagem inferior mostra o abdômen sem os apêndices swimmeret. Com o abdômen, um corte deve ser feito no shell ao longo da fronteira, laterais inferiores de cada lado do abdômen. Cuidados devem ser tomados para não cortar profundamente o lagostim. Para ajudar no processo de corte a casca, o corte deve ser feito com a tesoura apontando slighting baixo para o lado ventral e em um ângulo. Seguem o padrão shell natural das linhas do crustáceo que correm o comprimento de cada segmento (Figura 6). <br/> Figura 6. Scissors são colocados em um ângulo e seguir o alinhamento natural da casca. Não corte muito profundo e destrua a preparação. A seta cabeças apontam para a linha natural ao longo de cada segmento que deve ser seguido para os cortes. Remover a porção ventral da concha. Tome cuidado para não destruir os músculos abdominais. Use uma pinça para remover a porção ventral. Quando a porção ventral da concha é removida, uma massa branca de tecido pode ser visto em cima dos músculos flexores profundo. Este tecido pode ser retirado cuidadosamente com uma pinça. Figura 7. Retirar a parte ventral da concha com uma pinça. Puxar para cima e para trás sobre a porção ventral de remover. Não destrua os músculos sob o shell ventral. Figura 8. Puxar para trás sobre a porção ventral do shell que deve ser descartado. Figura 9. Corte a porção ventral da preparação com a tesoura e descarte. O trato GI, um pequeno tubo que corre ao longo da linha mediana dos músculos flexores profundo, pode ser removida do lagostim. Aperte a parte superior do trato com a pinça e se afastar do abdômen. Corte a parte inferior do trato – no final da cauda. Lavar a dissecção com solução salina para assegurar os resíduos fecais não interferir com a preparação. Figura 10. A imagem mostra a remoção do trato gastrointestinal a partir da preparação. Usar pinos dissecção para garantir a preparação para a placa de Petri. Os cantos superior e inferior da preparação deve ser preso ao prato. Solução salina deve ser vertido em placa de Petri e cobrir completamente a preparação até que as gravações são realizadas intracelular. Este prato deve ter uma dissecção Sylgard revestimento (Dow Corning) na parte inferior (1cm de espessura), de modo que os pinos de insetos pode ser preso a ele. Preparações dissecados são banhadas em solução salina lagostas padrão, modificado a partir da solução de Van Harreveld (1936), que é feita com 205 NaCl; 5.3KCl; 13,5 CaCl 2; 2H 2 O, 2,45 MgCl 2; 6H 2 O, 5 HEPES e ajustados para pH 7,4 (em mM). 2.2) Gravação Intracelular Figura 11. Configuração geral do equipamento de gravação. Placa de Petri com a preparação deve ser colocado sob o microscópio e fixado com cera no fundo do prato para impedir o movimento. Figura 12. A colocação da preparação no microscópio. Use cera para proteger a placa de Petri e preparação. Dois fios, cada um com um pequeno pedaço de fio de prata ligado a uma extremidade deve ser obtida. O fio de prata devem ser mergulhados em uma pequena quantidade de água sanitária por cerca de 20 minutos para obter um revestimento Ag-Cl. Lavar os fios com água antes de usar. A pipeta de vidro intracelular deve ser obtido e cuidadosamente backfilled com uma longa agulha conectada a uma seringa preenchida com uma solução de KCl 3M. A pipeta deve ser virado para baixo (com a abertura virada para o chão) e preenchido com solução. Isso irá assegurar que qualquer excesso de KCl por gotejamento na parte de trás do eletrodo. Verifique se não KCl corre ao longo da pipeta de vidro que vai entrar no banho de solução salina. Vire a pipeta na posição vertical quando terminar o preenchimento com solução de cloreto de potássio. O fio de prata pode então ser colocado na pipeta. A outra extremidade está ligado ao pólo + (positivo) no palco cabeça amplificador. A pipeta é então fixado na sonda do eletrodo. Cuidados devem ser feitas para não quebrar a ponta do eletrodo. Um terceiro fio ligado à gaiola de Faraday deve ser colocado no pólo verde da fase de cabeça. Por fim, o fio de Ag do chumbo restantes devem ser colocados no banho ea outra extremidade ligado ao pólo – (negativo) mostrado abaixo. Um fio também deve ser colocada a partir da gaiola de Faraday para a porção terra do conversor AD Powerlab. O estágio de cabeça estiver conectada ao "input-sonda" na aquisição / amplificador (Powerlab). Figura 13. Estágio de configuração da cabeça. O fio conectado à entrada verde do palco cabeça é aterrado para o amplificador ou gaiola de Faraday. O fio conectado à entrada vermelho está ligado ao fio do eletrodo. A entrada de preto é usado para conectar-se a solução de banho. Figura 14. "Test toggle" está na linha de baixo para testar eletrodo resistance.The botão "grosseiro" também é encontradosob DC offset que deve ser transformado relógio contador sábio. Ganho é definido como 50, que amplifica os sinais por um fator de cinqüenta. O fio terra do palco cabeça é colocada no pino "GND" abertura jack. O software LabChart devem ser abertas no desktop ou laptop. Ajustar o gráfico para exibir apenas um canal, clicando em "Setup", depois em "configurações Channel." Em "Configurações Channel," número de mudança de canais para um. Clique em "OK". No topo do gráfico canto, à esquerda, ciclos por segundo deve ser 2K. Set volts (eixo y) para cerca de 200mV a 500mV. Clique em "Canal 1" na parte direita da tela. Clique em "amplificador de entrada." Verifique se a caixa diferencial está marcada. A saída do amplificador deve estar em um canal. As seguintes configurações devem ser usadas com o amplificador: High Pass-DC Notch Filter-OFF Low Pass-20kHz Capacidade Comp .- anti-horário DC offset Belas e Curso botão anti- DC Offset (+ OFF) – OFF Ganho knob-50 Entrada (DIFF MONO GND) – DIFF MODE (STIM-GATE-REC) – REC ΩTEST-OFF Como uma medida da resistência do eletrodo, a tensão deve ser dividido pelo atual, que é de 2,0 nA (ou seja, a lei R = V / I, ou de Ohm). O valor resultante é a resistência do eletrodo de vidro. A resistência deve ser 20-60 megaohms. Mais baixos (<20) e alta resistência (> 100) não são aceitáveis. Uma vez que a resistência foi determinada, gravações intracelular pode começar. Coloque a ponta do eletrodo de vidro para o banho de solução salina. Certifique-se de um fio terra também está no banho de solução salina. Para iniciar a gravação, pressione iniciar na parte inferior da tela. Certifique-se que o ganho é definido como 5 V / div. Use o botão de curso sobre o amplificador para mover a linha na LabChart a zero antes de inserir o eletrodo. O botão de alternância deve ser ligado e depois desligado várias vezes a fim de testar a resistência do eletrodo. Em seguida, a amplitude dos valores resultantes devem ser medidos. Coloque um marcador na linha de base estável e em seguida, coloque o segundo no pico de obter a resistência do eletrodo. Use a sonda eletrodo e microscópio para inserir o eletrodo para os músculos longitudinal (DEM ou DEL1 ou DEL2) da preparação (ver Figura 16). O eletrodo deve apenas ser inserida no músculo. Não penetram através do músculo. Uso de microscópio e configurações sonda a fim de encontrar os músculos longitudinal e para inserir os eletrodos no músculo. O iluminador de alta intensidade deve ser ajustada para ver claramente o músculo, o eletrodo está sendo inserido. Ao picar fibras musculares nesta preparação um pode executar geralmente em espaços e fissuras dentro do músculo. Esta é a razão pela qual o potencial de membrana pode aparecer, em seguida, desaparecer, reaparecer. Figura 15. Inserção de eletrodo no músculo. Para medir o potencial de membrana, use o botão grossa no amplificador para mover a linha na LabChart a zero antes de inserir o eletrodo. Poke uma fibra muscular. Em seguida, medir a amplitude dos valores resultantes. Colocar um marcador na linha de base estável e registrar o valor. A diferença no marcador eo cursor ativo é exibido no lado direito da tela. O valor é dá a tensão. A tensão registrados podem precisar ser dividida pela quantidade de amplificação no amplificador (amplificação de 10x ou 100x, por exemplo). A tensão deve ser convertida de volts para milivolts (1 V = 1000 mV) se os valores são informados sobre o software como volts. Cuidadosamente use o microscópio e manipuladores para remover o eletrodo do músculo. Poke outra fibra muscular e observe o potencial de repouso. Deve-se tomar várias gravações e se sentir confortável com as medidas, bem como direcionar o eletrodo intercelulares na fibra muscular de interesse. O eletrodo provavelmente não vai ficar em uma fibra muscular durante a mudança de todos os alteraram diferentes [K +] soluções para fora. É melhor retirar o eletrodo, em seguida, altere a solução, então penetrar novamente para evitar danos ao músculo. É melhor para obter três leituras por solução de fibras musculares separados e use uma média para evitar leituras falsas. Use uma seringa para remover e descartar a solução salina a partir da placa de Petri. Placa de Petri deve ser preenchido com a concentração imediatamente superior da solução de cloreto de potássio solução salina, que abrange a preparação completamente. O mesmo processo deve ser repetido com cada solução de potássio e as mudanças na tensão / potencial deve ser observado e registrado. A série de [K +] de soluções salinas lagostas que usamos são: 5.4, 20, 40, 60, 80, 100 mM. 2,3 Anatomy) Agora que a fisiologia é concluída, podemos examinar os associadosanatomia das fibras musculares e padrão de inervação. Transfira a preparação para o prato e adicione a coloração azul de metileno (1 grama de azul de metileno misturado com 100 mL de solução salina lagostas). Deixe a solução salina banhar a preparação para 5 minutos e depois remover e adicionar soro fisiológico lagostas frescas, sem a mancha. A anatomia destes músculos tem sido descrita em detalhes ao longo dos anos (Huxley, 1880; Pilgrim e Wiersma, 1963). Só recentemente é que alguns dos músculos foi descrito anatomicamente, fisiologicamente e bioquimicamente (Cooper et al, 1998;. Griffis et al, 2000;. Sohn et al, 2000).. O layout geral anatômica dos músculos é mostrada na Figura 16 (lado direito da figura para esta finalidade). Procure o principal nervo que inerva principalmente os músculos dentro de um segmento. Esboçar o padrão de inervação para o SEM, DEL2, DEL1 e DEM músculos em um segmento. O abdômen precisa ser estendido totalmente fixando a preparação no prato com firmeza. Em seguida retire o soro e adicionar a solução de fixador. A solução é corrigir uma solução de Bouin (Preparado com ácido pícrico saturado, formaldeído e ácido acético; Sigma-Aldrich Co.). CUIDADO. Não fique esta solução na pele ou nos olhos. Evitar os vapores da solução, trabalhando sob a coifa. Se os seus olhos começam a queimar os olhos lavar imediatamente no lava-olhos. Deixe a solução de Bouin permanecer na preparação para cerca de 10 minutos e então use uma pipeta e trocar a solução para solução salina. Corte um pedaço fino de DEL1 DEL2 ou fora do músculo e coloque sobre uma lâmina de vidro. Rotular o slide. Repita o procedimento para o músculo SEM. Exibir o padrão de bandas do sarcômero em ambas as preparações de tecido. Você pode usar o microscópio composto e ajustar os objectivos de acordo com ver os padrões de bandas. Se possível tire uma foto digital através do olho peças do microscópio (nota: algumas câmeras de telefone celular funcionam bem para esse procedimento). Figura 16. Desenho esquemático de uma visão ventral da parte dorsal do abdômen lagostas mostrando a musculatura extensora de cada segmento. O músculo do abdômen dorsal da membrana (DMA) e da cabeça superficial do músculo extensor acessório (SEAcc) ocorrem em segmentos de 1 a 5 do abdome com uma orientação diferente para cada segmento. Com exceção do segmento 1, esses músculos têm seus locais de fixação em sua extremidade anterior ao tergito calcificada e na extremidade posterior da membrana articular. No segmento 1, os músculos homólogos têm seus pontos de ligação anterior com a membrana articular localizado entre o tórax eo abdômen. A ilustração foi baseada em montagens fotográficas de azul de metileno preparações coradas. No lado esquerdo da figura todos os músculos extensores profundos foram removidos para mostrar o dorsal músculos extensores superficiais. Escala = 2,35 mm. (Extraído de Sohn et al. 2000). 3. Resultados As seguintes perguntas e processamento de dados ilustrar os princípios e os objectivos principais para este procedimento laboratorial. Plot as medidas obtidas para os potenciais de repouso da membrana em cada [K +] fora usado. Veja se as linhas observados e hipotéticos são combinados em suas encostas. Para traçar os valores de usar um enredo semi-log com o eixo-x de variadas [K +] como um log eo eixo y dos potenciais de membrana (como mostrado abaixo, Figura 17). (Download papel de gráfico livre, se necessário http://incompetech.com/graphpaper/logarithmic/ ) Figura 17. Gráfico de papel Use o potencial de membrana de repouso média obtida em 5,4 mM [K +] para fora para iniciar as linhas hipotéticos e observados para a comparação. Se as linhas não correspondem discutir por que isso pode ser. Se você alterou o nível externo de íons Na +, você poderia esperar o mesmo tipo de alterações, como observado para alterar a concentração de K +? Como bem fez a mancha azul de metileno os músculos, em comparação com os nervos? Por que poderia haver diferenças? É azul de metileno utilizado hoje para identificação de tecidos ou células vivas de contraste em humanos? Qual é a relação com Sigmund Freud e manchas usado em lagostas? Nota alguma diferença nos padrões de sarcômero entre o DEL e músculos SEM. Se assim for, o que poderia ser a razão? Será que todos os músculos têm o mesmo distâncias sarcômero em repouso? Desenhe o padrão muscular bandas que você observou com o microscópio e rótulo tanto da figura como possível (em relação à anatomia muscular conhecida sarcômero). 4. Medição Re Synapticsponses 1) INTRODUÇÃO A preparação do músculo abdominal extensor utilizado para demonstrar o potencial de repouso é também ideal para demonstrar a indução de respostas sinápticas no NMJs de vários músculos. Alguns músculos em crustáceos são seletivamente inervados por qualquer um fásica ou um tônico do neurônio motor, apesar de algumas fibras individuais podem ser inervadas por ambos fásicas e tônicas neurônios motores excitatórios, como para o músculo extensor do crustáceo andando pernas (Atwood, 2008; ver JOVE id produção # 2319-Wu e Cooper, 2010) e mais outros músculos do membro (Wiersma, 1961a). Por estimular seletivamente neurônios motores fásicas e tônicas, as diferenças fisiológicas na EPSPs pode ser medido. Neurônios motores fásicos produzem rápida contração muscular das fibras musculares e evocam EPSPs na ordem de 10-40 mV. A resposta fásica podem deprimir rapidamente com 5-10-Hz trens de estimulação. Os neurônios motores tônica dar origem a EPSPs menores que podem ser facilitada na presença de uma maior freqüência (10-50 Hz) de estimulação. Estruturalmente, os terminais pré-sinápticos fásicas e tônicas na NMJs são diferentes (Atwood e Cooper, 1996; Bradacs et al, 1997;.. Cooper et al, 1998). Surpreendentemente, o fenótipo das respostas fisiológicas fásica podem sofrer uma transformação para um estado como tônico-condicionado eletricamente pelos neurônios fásicos por algumas horas diárias durante sete dias (Cooper et al, 1998;. Mercier e Atwood, 1989). Também a sensibilidade para neuromodulação do NMJs transformada é primordial para investigar a regulação da expressão do receptor (Griffis et al., 2000). Nessa preparação relativamente robusta (músculos lagostas abdominal), ambas as respostas tônica e fásica podem ser facilmente gravados e analisados ​​para a facilitação e / ou depressão das respostas sinápticas com paradigmas estimulação variada. Com esses preparativos, os alunos serão capazes de reconhecer generalidades das respostas fásicas e tônicas sináptica estimulando um feixe de nervos. Uma preparação adicional MNJ apresentada é utilizada para monitorar a atividade motora intrínseca e sensorial de estímulo a atividade motora induzida do SNC. Este é o músculo flexor superficial no lado ventral do abdômen lagostim. Esta preparação também será usado para monitorar o sensório-motoras CNS-músculo-circuito e os efeitos de neuromoduladores (Strawn et al., 2000). Em cada um dos segmento abdominal (exceto o último) há três grupos funcionais dos músculos: (1) aqueles que controlam pleópodo movimento (pleópodes), (2) três músculos extensores e (3) três músculos flexores. Os flexores e extensores são grupos antagônicos de músculos que trazer de flexão abdominal ou extensão, fazendo com que a rotação sobre as dobradiças intersegmentar. A musculatura fásica ocupa a maior parte do volume do abdômen, enquanto os músculos tônicos constituídos por folhas finas de fibras que se estendem a dorsal (extensores) e aspecto (flexores) ventral de cada segmento abdominal. Em lagostas, o tônus ​​dos músculos flexores abdominais de lagostas são inervados em cada segmento de meia por cinco motoneurônios e por um neurônio periférico inibitória. Os motoneurônios excitatórios uso glutamato como um neurotransmissor. Glutamato despolariza as fibras musculares, causando um aumento da permeabilidade principalmente para os íons de sódio. Os neurônios inibitórios liberação ácido gama-amino butírico (GABA), que normalmente hiperpolariza as fibras musculares, causando um aumento da permeabilidade aos íons cloreto. Em alguns músculos crustáceos (principalmente nos membros), os neurônios periféricos inibitória sináptica fazer contatos com os terminais do neurônio motor, bem como com as fibras musculares e reduzir a quantidade de transmissor liberado pelo neurônio motor (inibição pré-sináptica) (Dudel e Kuffler de 1961 ). Este fenômeno não está presente nos músculos flexores tônica de lagostim. O cordão nervoso ventral de crustáceo é uma estrutura bilateral simétrica a todo o comprimento do animal. Existe um gânglio por segmento do corpo. No abdômen (6 segmentos), cada um gânglio contém várias centenas de neurônios, e cada um dos dois conectivos consiste de alguns milhares de axônios. Os corpos das células nervosas formam uma camada de corpos celulares de espessura na superfície ventral de cada gânglio. Imediatamente acima da camada de células do corpo é uma malha fina de processos neuronais, o neuropile. Todas as interações sinápticas ocorrem aqui, os corpos celulares são desprovidos de sinapses. Cada gânglio abdominal (exceto o último) tem três raízes de cada lado. A primeira raiz contém axônios dos neurônios que inervam a musculatura pleópodo e axônios sensoriais; a segunda raiz contém axônios que inervam fásicas e tônicas musculatura extensora e axônios sensitivos, ea terceira raiz, que deixa o cordão nervoso vários milímetros caudal à ganglionares, contém os axônios inervating musculature flexor fásica e tônico. Existem dois ramos da terceira raiz. O ramo profundo (IIIa) inerva músculos flexor apenas fásica. O ramo superficial da raiz terceiro (IIIb) em cada metade-segment contém seis axônios, que inervam os músculos flexor tonic. Os neurônios inervam a flexor tonic são espontaneamente ativa, diferentemente os neurônios fásica eferentes e numa preparação bom, eles continuarão a fogo para muitas horas depois abdômen foi removido do animal. Para uma revisão do natureza histórica das descobertas feitas nestes preparações abdominal ver Atwood (2008). Os corpos celulares de quatro dos neurônios motor e do neurônio periféricos inibitória innervating músculo flexor tonic em qualquer segmento meia estão localizados no gânglio desse segmento. Corpo celular dos restantes neurônio motor está localizado no gânglio próxima caudal. Esses neurônios pode ser confiavelmente distinguidos uns outras com base extracelluarly gravadas spike amplitudes. Se o músculo flexor tonic de um segmento meia é removida juntamente com gânglios duas contendo os neurônios innervating este músculo, cinco neurônios geralmente mostram algum grau de atividade espontânea. Esses neurônios são numerados com base relativa amplitude spike extracelular, em ordem ascendente. f1 para f4 são motoneurônios e f5, o maior neurônio spontaneously ativo, é o inibidor flexor periférico. f6, o maior neurônio motor, é um neurônio motor excitatórios que raramente é spontaneously ativo. A natureza espontânea de tonic atividade neurônio motor pode ser modulada por aplicação exógena de compostos ou fornecendo uma estímulo sensorial ao cuticle dentro mesmo segmento que está sendo monitorado para motor atividade nervosa. 2 Dissection) Obter a preparação extensor abdominal o mesmo procedimento como descrito acima para examinando os potenciais membrana descansando em relação potássio extracelular. A diferença é cuidar do feixe nervoso segmental que percorre lado da carapace. Este nervo será puxado em um eletrodo sucção que servirá como eletrodo estimulante. Estimular menos 1 Hz para monitoramento respostas fásica. Estimular com rajadas curtas de pulsos 10Hz para 1-20 estímulos enquanto monitora as respostas tonic. Os procedimentos experimental para cuidar out experimentos na crayfish músculos flexor tonic são diferentes e um precisa deixar o cordão nervoso ventral intact. Uma preparação consistindo de vários segmentos abdominal é feita. Este é obtido como segue: Um crustáceo de aproximadamente 60-10 cm de comprimento do corpo deve ser obtido (ou um tamanho gerenciável). Obter o crayfish segurando-da traseira da cabeça ou aproximadamente 2 ou 3 centímetros do traseira do olhos. Garantir que garras do crayfish ou boca não pode alcançar o experimentador ao manusear o crayfish. Alienar da cabeça e appendages após remover eles. Use a tesoura para remover rapidamente cabeça. Faça um corte limpo e rápido de trás dos olhos do lagostim. Figura 18. Imagem mostra colocação do corte para remover a cabeça do crayfish. As pernas e as garras da lagosta pode ser removido neste momento para evitar ferimentos. Estiletes sobre machos e pleópodes em ambos machos e fêmeas também pode ser removido (Figura 19 e 20). Em seguida, separe o abdômen do tórax. Fazer um corte longo da membrana articulando que une abdômen e tórax (Figura 20). Salvar a parte do abdômen do crustáceo e dispor do tórax. Figura 19. Imagem mostra a colocação do estiletes que podem ser removido do crayfish. Figura 20. Imagem mostra a colocação do corte para remover tórax do abdômen. Figura 21. Removal do tórax do abdômen. O corte deve ser feita em fashion circular longo da linha do juntando dos segmentos. Figura 22. A imagem top mostra o abdômen com appendages. Imagem inferior mostra a remoção do appendages abdominal. Lugar a preparação tail isolado em solução salina em um prato Petri grandes. Pin baixo a porção cauda e superior do preparação ao prato. Certifique-a preparação é segura. Use um bisturi para remover uma porção quadrado da lado ventral da preparação entre as costelas. Figura 23.Mostra onde o corte deve ser feitas para remover a poção ventral da preparação. Um corte pequenos devem ser feita (também pode ser feito com tesoura). Um flap devem ser cortados e levantou ascendente. O flap pode então ser removido com tesoura, expondo os músculos flexor profundo. O microscópio deve ser utilizado durante este processo para garantir precisão em removendo a porção ventral da preparação. Figura 24. Cutting preparação com tesoura para expor músculos. Figura 25. Imagem Top mostra o agarrando do retalho com forceps. Imagem inferior mostra a remoção do flap da preparação usando o microscópio. Figura 26. Exposure dos músculos flexor superficial. 3) Recording Intracelular: Figura 27. Configuração Globalmente do equipamento gravação. Placa de Petri com a preparação deve ser colocado sob o microscópio e fixado com cera no fundo do prato para impedir o movimento. Figura 28. Shows a colocação da preparação sob o microscópio. Use cera para proteger a placa de Petri e preparação. Dois fios com comprimento curto de wire prata anexado a uma extremidade deve ser obtida. O fio de prata devem ser mergulhados em uma pequena quantidade de água sanitária por cerca de 20 minutos para obter um revestimento Ag-Cl. Lavar os fios com água antes de usar. Uma pipeta vidro intracelular devem ser obtidos e cuidadosamente encheu com uma solução KCl (3 M). A pipeta deve ser virado para baixo (com a abertura virada para o chão) e preenchido com solução. Este último assegurará que qualquer KCl excesso gotejará out parte traseira do eletrodo. Ser certeza nenhuma KCl percorre a pipeta vidro que entrará em o banho salina. Vire a pipeta na posição vertical quando terminar o preenchimento com solução de cloreto de potássio. O fio de prata pode então ser colocado na pipeta. Outra extremidade é conectado à + pole (positivo) no palco cabeça. A pipeta é então fixado na sonda do eletrodo. Cuidados devem ser feitas não quebrar a pipeta eletrodo. Um terceiro fio ligado à gaiola de Faraday deve ser colocado no pólo verde da fase de cabeça. Por fim, o fio de Ag do chumbo restantes devem ser colocados no banho ea outra extremidade ligado ao pólo – (negativo) mostrado abaixo. Um fio também deve ser colocada a partir da gaiola de Faraday para a porção terra do conversor AD Powerlab. O estágio cabeça é conectado à "input sonda-" na aquisição / amplificador (Powerlab). Figura 29. Configuração estágio Head. O fio conectado à parte verde do palco cabeça é aterrado ao amplificador ou gaiola Faraday. O fio conectado à porção vermelha é conectado ao fio eletrodo. A porção preto é usado para conectar à solução balnear. Figura 30. "Test toggle" é na linha inferior para testar resistência eletrodo. O knob "coarse" também é encontrado sob DC offset que deve ser virou clock counter wise. Ganho é definido como 50, que amplifica os sinais por um fator de cinqüenta. O fio terra do palco cabeça é colocada no pino "GND" abertura jack. O software LabChart devem ser abertas no desktop ou laptop. Ajustar o gráfico para exibir apenas um canal por "Setup" click, então "configurações Channel." Em "Configurações Channel," número de mudança de canais para um. Clique em "OK". No topo do gráfico canto, à esquerda, ciclos por segundo deve ser 2K. Set volts (eixo y) para cerca de 200mV a 500mV. Clique em "Canal 1" na parte direita da tela. Clique em "amplificador de entrada." Verifique se a caixa diferencial está marcada. A saída do amplificador deve estar em um canal. As seguintes configurações devem ser usadas com o amplificador: High Pass-DC Notch Filter-OFF Low Pass-20kHz Capacidade Comp .- anti-horário DC offset Belas e Curso botão anti- DC Offset (+ OFF) – OFF Ganho knob-50 Entrada (DIFF MONO GND) – DIFF MODE (STIM-GATE-REC) – REC ΩTEST-OFF Medir a resistência eletrodo, a tensão deve ser dividido pelo atual, que é 2,0 nA. O valor resultante é a resistência do eletrodo de vidro. A resistência deve ser 20-60 megaohms. Uma vez que a resistência foi determinada, gravações intracelular pode começar. Coloque a ponta do eletrodo vidro no banho saline. Certifique-se de um fio terra também está no banho de solução salina. Para começar gravação, pressione "start" no fundo da tela. Certifique-se que o ganho é definido como 5 V / div. Use o botão de curso sobre o amplificador para mover a linha na LabChart a zero antes de inserir o eletrodo. O botão de alternância deve ser ligado e depois desligado várias vezes a fim de testar a resistência do eletrodo. Em seguida, a amplitude dos valores resultantes devem ser medidos. Lugar um fabricante linha base constante e então coloque o segundo no pico obter a resistência eletrodo. Use a sonda eletrodo e microscópio para insert o eléctrodo na muscular. Não penetram através do músculo. Use microscópio e configurações sonda a fim encontrar a fina camada de fibra muscular e inserir os eletrodos nas fibras. O iluminador alta intensidade pode ser usado como fonte luz quando penetrante músculo. Figura 31. Inserção de eletrodo no músculo. Cuidado deve ser tomado para evitar danificar o raízes nervosas aos músculos superficial. É aconselhável manter o banhando saline os preparativos cool (10-15 graus Celsius) e bem oxygenated enquanto execução dos procedimentos experimental. Se unidades arrefecimento não estão disponíveis substituir o salina com fresco, salina resfriada regularmente. Gás oxigênio, ou pelo menos ar, deve ser bubbled através do salina. Registrar a atividade espontânea do EPSPs. Observe o tamanhos diferentes do EPSPs e se IPSPs estão presentes. Muito cuidadosamente tomar uma pequena paint bush e por mão estimular longo da borda cuticle dentro mesmo segmento que um está monitorando a atividade espontânea. Nota uma mudança em freqüência das respostas e se EPSPs size diferentes aparecem que não estavam lá antes estimulando a cuticle. Figura 32. Preparação com estimulante raízes brush e nervo. (Modificado de Strawn et al., 2000) A estimulação pode ser repetido após cuidadosamente trocando o banho salina com um contendo um neuromodulador tais como serotonin (1 microM) ou salina aeradas com CO 2. Observe o efeito no perfil atividade para um dado estímulo. Também nota se trocando costas salina para fresco retorna saline a atividade à sua condição inicial. Seguinte, um pode monitorar atividade neural dentro do circuito neurônio sensório-CNS-Motor várias maneiras. Podemos usar um eletrodo sucção vez de um eletrodo intracelular (Figura 33) para monitorar a atividade neurônio motor. Na ponta do eletrodo sucção vidro, tubulação plástica é colocado que tem uma abertura do tamanho correto para pull nervo na ponta. A abertura não deve ser demasiado grande, como nervo cairia out; ou demasiado pequeno, porque o nervo seria danificado pela pressão do eletrodo. A tubulação plástico é puxado sobre uma chama e aparado volta ao tamanho necessário. Figura 33. Configure com sucção arranjo gravação eletrodo. Posicione o micromanipulador numa posição onde o eletrodo sucção tem fácil acesso ao banho salina. Sucção up saline até estiver em contato com o fio prata dentro do eléctrodo sucção. Arrange outro fio sobre o corte colaterais da eletrodo sucção perto do ponta do eletrodo, assim ambos fios estarão contato com o banho salina. Como para a monitorização elétrica conectar o Amplificador Diferencial AC / DC (amplificador) ao 26T Lab Power. Fazer isso ligando o cabo adequada partir Input 1 no 26T PowerLab à saída no amplificador. Os controles instrumento amplificador deve ser definido para as seguintes configurações: High Pass-DC Notch Filter-OFF Low Pass-20kHz Capacidade Comp .- anti-horário DC offset Belas e Curso botão anti- DC Offset (+ OFF) – OFF Ganho knob-50 Entrada (DIFF MONO GND) – DIFF MODE (STIM-GATE-REC) – REC ΩTEST-OFF Conectar o estágio cabeça ao 'input sonda-' no amplificador. Conectar o fios elétricos do eletrodo sucção ao estágio cabeça. Os fios deve ser conectado com o vermelho (positivo) à esquerda top, verde (ground) no meio, preto (negativo no fundo. Isto é indicado na Figura 34. O fio terra pode apenas ser posto no banho salina. Figura 34. Cabeça configuração estágio Agora ligar o cabo USB da 26T PowerLab ao laptop. Assegurar que tanto amplificador e PowerLab26T estão conectados e ligado antes abertura LabChart7 no computador. Aberta LabChart7. O LabChart caixa Welcome Center irá pop aberto. Feche. </Li> Clique em Setup Clique em configurações de canal. Alterar o número de canais a 1 (parte inferior esquerda da caixa) empurrar OK. No canto superior esquerdo do gráfico definir a ciclos por segundo para cerca de 2k. Definir o volts (eixo y) para cerca de 500 ou 200mV. Clique no Canal 1 da direita do gráfico. Clique em Amplificador de Entrada. Garantir que as configurações: single-ended, ac acoplado, e invertido (inverte o sinal se necessário), e anti-alias, são verificados. Para começar a começar a gravação, prima. Podemos gravar a partir do ramo da raiz 3 º, que inerva o músculo flexor superficial (ramo IIIb) para monitorar o tamanho dos potenciais de ação com a gravação extracelular. Os impulsos nervosos extracelular são referidos como "picos". Lembre-se que há cinco neurônios Excitor motor e um inibidor de neurônio motor desta raiz (Kennedy e Takeda, 1965; Velez e Wyman, 1978). Estimulação da cutícula com uma escova ou a exposição de neuromoduladores podem ser utilizados (Figura 35). O pincel pode ser usado com a mão ou para a estimulação consistente que poderia ser montada em um micromanipulador para controlar a quantidade de pressão e movimento. Figura 35. Atividade da raiz 3 º, antes e durante a estimulação cuticular em solução salina (superior) e em 100 nM 5-HT (parte inferior). O tempo durante a estimulação cutícula é indicado pela barra. Observe o aumento da actividade, antes e após a estimulação quando a preparação é banhado por 5-HT (modificado de Strawn et al., 2000). Podemos gravar a partir de 1 º ou 2 raízes nd fazendo um en passant gravação do nervo, ou podemos transecto a raiz longe do VNC e entrada de puro registro sensoriais decorrentes da periferia, que seria o envio de sinais para o VNC. Assim, você iria gravar a partir da raiz transeccionados levando para a periferia para a atividade sensorial. A raiz 2 º contém muito grandes axônios aferentes primários dos órgãos musculares receptor (MRO) e axônios eferentes para menores de neurônios extensor motor (Campos e Kennedy, 1965). Há muitos axônios sensitivos na 1 ª e 2 ª raízes. Os neurônios mecanosensorial têm conexões diretas, por sinapses elétricas com os axônios gigantes lateral (LG) (Krasne 1969; Zucker, 1972). Além disso, os neurônios mecanosensorial são conhecidos para excitar interneurônios via sinapses químicas. Para examinar como os estímulos sensoriais podem influenciar a atividade dos neurônios do motor, através de um sensório-CNS-circuito do neurônio motor, que pode gravar as respostas sinápticas em um músculo. Vários aspectos do circuito, vamos utilizar pode ser examinado. Por exemplo, nós podemos gravar a partir da raiz do nervo sensorial isolado ou a raiz do motor com ou sem entrada sensorial intacta na VNC Para analisar as gravações de freqüência do ponto, pode-se contar ao longo de um período de tempo em diferentes condições. As medidas podem ser feitas antes da escova de estimulação e durante a estimulação do pincel para um determinado período de tempo (Figura 35). Pode-se repetir as condições 5 vezes e obter a variação percentual média da frequência como uma medida para fazer comparações. Pode-se também aplicar compostos exógenos tais como a serotonina (Strawn et al., 2000) ou de acetilcolina (Ach), a nicotina ou glutamato. Várias ações comportamentais têm sido descritos para a nicotina em invertebrados. Isto sugere a presença de receptores nicotínicos (Tsunoyama e Gojobori, 1998). O glutamato é um neurotransmissor excitatório grandes na maioria dos invertebrados na MNJ e Ach é o principal neurotransmissor excitatório no SNC (Monoghan et al, 1989;. Watkins, et al, 1990). Pode-se tentar heptanol ou CO 2 bolhas salina uma vez que irá separar o lagostim septadas (ou gap) junções dentro do circuito como o Dr. M. Bierbower Sonya (University of Kentucky) mostrou em sua pesquisa de dissertação. Essa ação pode contribuir para o comportamento animal alterou toda quando expostos a altas de CO 2 no ambiente (Bierbower e Cooper, 2010). Quando você estimular a cutícula com uma escova e de entrada da unidade sensorial e gravar uma resposta em neurônios motores, observe se há uma diferença na atividade antes e durante heptanol ou exposição ao CO 2. Isto pode ou não pode sugerir junções de ter um papel no sensório-CNS-circuito do neurônio motor.