유전자 단체는 종종 기능 수준에서 설명할 남아있다. 이 방법은 베꼈는데 SNPs에 대한 heterozygous 세포를 분석하여 유전자 발현에 대한 표현형 – 관련 유전자 마커의 효과를 평가하는 것을 목표로하고있다. 이 기술은 allele 특정 뇌관 확장 제품을 수치 든 – TOF 질량 분석법에 의해 정확한 측정이 가능합니다.
일반 복잡한 특징과 중요한 유전자 협회의 수가 지속적으로 증가하고있다. 그러나 이러한 단체의 대부분은 분자 수준에서 이해되지 않았습니다. phenotypes에 DNA 변종의 효과를 중재하는 메커니즘 중 하나는 복잡한 특성 1 특히 관련성이 높은 것으로 표시되었습니다 유전자 표현입니다.
이 방법의 휴대폰 컨텍스트 유전자 발현에서 특정의 DNA 시퀀스의 효과를 테스트합니다. 원리는 질병 (위험 변종) 2,3과 관련된 DNA 시퀀스 중 하나 사본을 가지고 세포를 분석, 유전자의 두 대립 유전자에서 발생하는 성적의 상대적 풍부한을 측정하는 것입니다. 따라서,이 방법에 사용되는 전지는 두 근본적인 genotypic 요구 사항을 충족해야합니다 그들은 DNA의 위험 변종에 대한 그들의 염색체 기원 (그림 1)에 따라 기록을 구별할 수있는 DNA 마커, 일반적으로 코딩 polymorphisms, 모두를위한 heterozygous해야합니다. DNA 위험 변종과 DNA 마커는 동일한 allele 주파수를 필요 아니지만 유전자 마커의 단계 (haplotypic) 관계를 이해해야합니다. 관심있는 유전자를 표현하는 세포 유형을 선택하는 것도 중요합니다. 이 프로토콜은 섬유아 세포에서 핵산을 추출 채택 절차를 구체적으로 참조되지만 이러한 방법은 기본 세포 등 다른 세포 유형에 동일하게 적용됩니다.
DNA와 RNA가 선택한 셀 라인에서 추출하고 cDNA가 생성됩니다. DNA와 cDNA는 코딩 DNA 마커 사를 대상으로 설계된 프라이머 확장 분석과 함께 분석하고 있습니다. 뇌관 연장 분석은 제조 업체의 사양에 따라 MassARRAY (Sequenom) 5 플랫폼을 사용 수행됩니다. 프라이머 확장 제품은 다음 매트릭스를 이용한 레이저 탈착 / 질량 분석계 (MALDI-TOF/MS) 비행의 이온화 시간에 따라 분석됩니다. 선택 마커가 heterozygous 있기 때문에 그들은 MS의 프로필에 두 개의 봉우리를 생성합니다. 각 피크의 면적은 사본의 풍요에 비례하고 allelic 비율 (allele 1 : allele 2) 생성하는 MassARRAY의 Typer 소프트웨어의 기능을 측정할 수 계산합니다. cDNA에 대한 획득 allelic 비율은 allelic 비율이 1시 1분 기술 아티팩트에 대한 올바른 될 예정입니다 게놈 DNA에서 측정되는을 사용하여 표준입니다. 1 크게 다른 표준 allelic 비율로 표식은 표현형와 관련된 유전자 변종은 유전자 발현에 영향을 미칠 것을 제안, 동일한 셀에 두 개의 염색체에서 발생하는 성적 증명서의 양이 다르다는 것을 나타냅니다. 실험 컨트롤이 결과를 확인하는 데 사용해야합니다.
이 방법은 사본 수준의 생체내 allele 특정 차이 평가에 의해 유전자 발현에 질병 관련 유전자 변종의 효과의 평가를 수 있습니다. 이 프로토콜의 상대적인 대본 풍부한이 든 – TOF하지만 같은 TaqMan 6,7와 같은 allele 특정 부량을 수 있도록 다른 기술에 의해 측정, 사용할 수 있습니다. 이 방법의 주요 제한은 베꼈는데 코딩 마커의 가용성이다. 원칙에 따라 방법은 여기에 설명된하지만, polymorphisms 다른 클래스의 활용, 설명되었습니다. haploChip 분석은 transcriptional 시작하거나 II 8 효소를 RNA 특정 항체와 격리 염색질 immunoprecipitated 자료에있는 것입니다 유전자의 최종 사이트의 1킬로바이트 내에 위치한 마커를 사용하여 allele 특정 표현을 측정합니다. 템플릿 RNA 9 헤테로핵 때 또는 intronic SNPs를 사용할 수 있습니다.
특정 프로토콜은 haploChip 분석과 함께, 여기에 설명된 dyslexia에 대한 후보 유전자 (또는 읽기 장애)를 식별하기 위해 성공적으로 사용되었습니다. 처음에는 유전자 협회 연구 dyslexia 세 유전자 10 스패닝되었습니다과 관련된 DNA 순서 확인. allele 특정 유전자 발현 분석은 dyslexia – 관련 DNA 변종 표현 변동의 존재에 세 유전자 중 하나만에 대한 관찰하지만 다른 두 11 것으로 나타났다.
The authors have nothing to disclose.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
PBS | Sigma | P-4417-100TAB | ||
SDS | Biorad | 161-0416 | ||
NaCl | VWR | 27788.366 | ||
Tris | Sigma | T1503-1KG | ||
EDTA | Sigma | E5134-500G | ||
RNase A | Qiagen | 19101 | ||
Proteinase K | Sigma | P2308-500MG | ||
Phenol: chloroform | Sigma | 77617 | ||
Chloroform | VWR | 100777C | ||
Ethanol | Sigma | 32221-2.5L | ||
Trizol | Invitrogen | 15596-018 | ||
RNeasy kit | Qiagen | 74104 | ||
SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080-044 | ||
Immolase Taq | Bioline | BIO-21048 | ||
dNTP | Sigma | DNTP100A | ||
Exonuclease 1 | NEB | M0293S | ||
Shrimp Alkaline Phosphatase | GE Healthcare | E70092Z | ||
SpectroCLEAN resin | Sequenom | 10053 | ||
MassEXTEND ddNTP/dNTP mix | Sequenom | Varies according to assay design | ||
MassEXTEND thermosequenase | Sequenom | 10052 | ||
Equipment | ||||
Chilled microcentrifuge | Eppendorf | |||
NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | |||
SpectroPOINT nanolitre dispenser | Sequenom | |||
SpectroREADER mass spectrometer | Sequenom |