Un allèle spécifique Assay expression du gène pour l'épreuve la base fonctionnelle des associations génétiques

Culture Cellulaire 1) Sélectionnez les types de cellules exprimant le gène d'intérêt. Sélectionner des lignées de cellules hétérozygotes à la fois pour des variantes de l'ADN des risques et transcrit le polymorphisme de codage au sein du gène d'intérêt (figure 1). Culture des lignées cellulaires sélectionnées selon les spécifications du fournisseur et de préparer 2 x 10 cm boîtes de Pétri pour l'extraction d'ADN et d'ARN, respectivement. Lorsque les cellules atteignent 80% de confluence lancer la procédure pour les cellules des récoltes et d'isoler l'ADN et l'ARN soit en suivant la procédure décrite ci-dessous ou en utilisant des kits disponibles dans le commerce. Extraction de l'ADN 2) Retirez le support de l'antenne, se laver avec du PBS et ajouter au plat 500 ul d'une solution de lyse (0,6% de SDS, 100 mM NaCl, 50 mM Tris, EDTA 20 mM et 50 ug / ml de RNase A). Rocher de la plaque doucement pendant 20 minutes à température ambiante. Racler le lysat cellulaire dans un tube à centrifuger et incuber à 37 ° C pendant la nuit. Ajouter la protéinase K à une concentration finale de 100 pg / ml et incuber à 37 ° C pendant la nuit. Extrait de l'ADN avec un volume égal de phénol-chloroforme pH 8, répéter, puis extrait avec un volume égal de chloroforme / alcool isoamylique. Précipiter l'ADN avec 1 / 10 ème volume de NaCl 3 M et 2,5 volumes d'éthanol 100%. Laisser sur la glace pendant 5 min, puis tourner à 13000 rpm pendant 30 min à 4 ° C. Laver l'ADN à l'éthanol 70%, permettant à l'air sec et remettre en suspension dans 200 ul de TE. Incuber à 65 ° C pendant 10 min puis laisser reposer 2 jours à température ambiante. Conserver à 4 ° C ou à long terme à -20 ° C. 3) Extraction de l'ARN Retirez le support de l'antenne, se laver avec du PBS, ajouter 1 ml de Trizol et incuber pendant 10 min à température ambiante. Racler les cellules, une pipette quelques fois, le transfert dans un microtube et incuber pendant 5 min. Spin pendant 10 min à 10000 rpm à 4 ° C. Transférer le surnageant dans un nouveau tube et ajouter 200 ul de chloroforme. Secouez et de spin pendant 10 min à 10000 rpm à 4 ° C. Transférer la phase aqueuse dans un tube frais et ajouter un volume égal d'éthanol à 70%. Chargez la solution à 1 ou 2 (selon le volume) et de spin colonne RNeasy pendant 30 sec à vitesse maximale. De là, suivre les instructions du kit RNeasy (Qiagen). 4) Préparation Nucleic Acid échantillon Quantifier l'ADN et la concentration d'ARN en utilisant un spectrophotomètre NanoDrop (Thermo Scientific). Préparer ADNc à partir de 500-1000 ng d'ARN en utilisant décamères aléatoire et SuperScript III de la transcriptase inverse (Invitrogen) selon les instructions du fabricant. 5) PCR et Assay extension d'amorce Conception de deux paires d'amorces de PCR pour chaque marqueur d'ADN, une paire pour l'amplification de l'ADN génomique et l'autre paire pour l'amplification de l'ADNc (figure 2). Placez avant et arrière d'amorces pour l'amplification d'ADNc dans les exons différents pour éviter la contamination génomique. Primer la conception pour obtenir un produit de PCR dans la gamme de 100-500 pb de longueur. Préparer une réaction 10 uL de PCR dont 0,5 U de Taq Immolase (Bioline) 0,8 mM de dNTPs, MgCl2 2 mM, 0,2 M de chaque amorce et 20 ng d'ADNc ou ADN soit. Amplifier chaque échantillon en quatre réactions indépendantes. Exécutez la réaction de PCR dans les conditions optimisées pour chaque paire d'amorces garder le numéro du cycle en phase linéaire de l'amplification. Retirer amorces PCR et dNTPs excès en incubant le produit de PCR avec l'exonucléase I et phosphatase alcaline de crevette (SAP) à 37 ° C pendant 20 minutes. Spot de chaque produit de PCR à deux reprises sur une plaque de 384 puits, de sorte que 8 mesures seront disponibles pour chaque échantillon. Conception de l'amorce d'extension avec la conception Assay (Sequenom) logiciel de sorte que la même amorce peut être utilisée pour les deux génomiques et d'ADNc produits de PCR. Précisez longueur de l'amorce de la gamme de 14-18 pb et mélanger vulgarisation, y compris des combinaisons de 3ddNTPs (Fig 2). Réaliser la réaction d'extension d'amorces et d'analyse MALDI-TOF/MS utilisant le système MassARRAY (Sequenom) conformément aux instructions du fabricant. Une réaction typique de l'extension d'amorces comprennent une étape de départ à 94 ° C pendant 2 min, suivie de 40 cycles de 94 ° C pendant 5 s, 52 ° C pendant 5 s et 72 ° C pendant 5 s. Les produits d'extension d'amorces sont nettoyés avec de la résine SpectroCLEAN et transférés sur microréseau (puce) par SpectroPOINT nanolitre distributeur. Les oligonucléotides étendu sont quantifiés par MALDI-TOF en utilisant un spectromètre de masse SpectroREADER. 6) Analyse statistique Vérifiez les résultats MALDI-TOF/MS avec le logiciel Typer MassARRAY pour la qualité générale de l'expérience. Extrait du rapport allélotypage qui comprend la zone de données de pointe. Pour chaque spectre individuel calculer larapport entre la surface du pic de l'allèle 1 et allèle 2 (rapport surface des pics). Pour chaque échantillon d'ADNc dérivent d'une moyenne surface du pic ratio et l'écart-type, en utilisant la fonction correspondante dans Excel, à travers les 8 mesures. Dériver le même rapport de la surface moyenne de pointe à travers le 8 measurments pour l'ADN génomique. Diviser le rapport d'ADNc dire par le ratio signifie génomique afin d'évaluer l'écart à l'attendus ratio de 1:1. 7) des contrôles expérimentaux Pour écarter les artefacts expérimentaux, répéter l'expérience au moins trois fois. Autant que possible la conception des essais, des marqueurs d'ADN supplémentaires. Conception de plusieurs paires d'amorces de PCR et des amorces d'extension de recuit à des brins à la fois avant et arrière. Chaque fois que possible, de test comme négatif contrôle des lignées cellulaires qui sont hétérozygotes pour les marqueurs de l'ADN, mais ne portent pas le risque de variantes génétiques associées au phénotype (Fig. 1 et Fig. 3) 8) Les résultats représentatifs Un exemple de l'allèle spécifique d'analyse d'expression est montré dans la figure 3, avec des exemples de traces par spectrométrie de masse. La figure montre les résultats de l'analyse de quatre allèle-spécifique des produits d'extension d'amorces réalisées sur 4 modèles différents. Les graphiques haut représentent les résultats obtenus à partir de l'analyse de l'ADN génomique de deux lignées cellulaires différentes, qui sont tous deux hétérozygotes pour un polymorphisme transcrit codage. Toutefois, seule lignée cellulaire A est hétérozygote pour la variante ADN risque (figure 1). Les graphiques du bas représentent les résultats obtenus à partir de l'analyse de l'ADNc générés à partir des mêmes lignées cellulaires. En raison de l'artefact expérimental premier pic est toujours plus élevé que le deuxième pic, même dans l'analyse génomique. Par conséquent, les résultats de l'analyse génomique sont utilisés pour normaliser les données d'ADNc. Après la normalisation, le ratio allèle est significativement différent de 1 dans une lignée cellulaire (où le second pic apparaît faible par rapport aux spectres d'autres), alors qu'elle est très proche de 1 dans la lignée cellulaire B. Les données suggèrent que la lignée cellulaire Un porte une variante de l'ADN, en phase avec l'allèle mesurée par le deuxième pic, ce qui réduit l'expression du gène en cours d'analyse. Lignée cellulaire B fournit un contrôle très pratique négative. Figure 1. Les lignées cellulaires stratégie de sélection de cellules en ligne. A et B sont hétérozygotes pour un marqueur de codage transcrit (triangle), mais seule lignée cellulaire A est hétérozygote pour la variante ADN risque (cercle). L'allèle bleu de la variante de risque est associé (que ce soit avec un effet direct ou parce que en étroite corrélation avec la variante fonctionnelle réelle) avec un faible niveau de la transcription. Figure 2. Allèle-spécifique de dosage extension d'amorce. Ce chiffre montre le travail d'écoulement de la procédure expérimentale menée à la fois pour l'ADN d'ADNc (à gauche) et de la génomique (à droite) des modèles. Des amorces de PCR (rectangles gris) sont conçues pour amplifier un polymorphisme hétérozygote codage (triangle). Pour éviter la contamination des amorces PCR génomique recuit séquences placées dans des exons différents (barres bleues) lorsque l'amplification est réalisée sur matrice d'ADNc. Le produit PCR est ensuite utilisé comme matrice pour une réaction d'extension d'amorces réalisée avec une amorce d'extension, une base de recuit à côté du polymorphisme, et la combinaison appropriée de trois didésoxynucléotides (ddNTP) terminateurs (carrés) et un désoxynucléotides (cercle) pour étendre l'apprêt d'un ou deux de base respectivement. Les produits résultant d'extension d'amorces ont des masses différentes qui permettent la séparation et la quantification par spectrométrie de masse MALDI-TOF. La quantité de produit correspondant à l'allèle bleu du marqueur d'ADN est relativement faible à l'allèle rouge. Figure 3. Résultats d'un allèle spécifique de dosage d'expression. La figure montre les résultats de spectrométrie de masse à partir de l'analyse effectuée sur l'ADN génomique et l'ADNc de la lignée cellulaire A et B lignée cellulaire (figure 1).