Summary

אנטיגן ספציפי In vivo להרוג Assay באמצעות תווית CFSE תאים היעד

Published: November 09, 2010
doi:

Summary

זיהומים רבים לתגובה CTL חזק, אבל מדי פעם, כמות התאים להגיב אינו תואם לשליטה של ​​הפתוגן<sup> 1</sup>. אחד המדדים לבחינת איכות CTL הוא היכולת שלהם להרוג במיוחד<sup> 2</sup>. תיוג CFSE של תאים היעד יכול לשמש כדי לחקור את איכות התגובה CTL<em> In vivo</em<sup> 3,4</sup>.

Abstract

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl אסתר (CFSE) יכול לשמש בקלות ובמהירות תווית האוכלוסייה תא עניין של בחקירה vivo. תיוג זה קלאסי שימשו במחקר התפשטות והגירה. בשיטה המוצגת כאן, יש לנו לקצר את ציר הזמן לאחר העברת המאמצת להסתכל הישרדות הרג epitope ספציפי שכותרתו CFSE תאים היעד 4-6. רמת הרג ספציפי של שיבוט CD8 + T תא יכולה להעיד על איכות התגובה, כמו הכמות שלהם עלולה להטעות. ספציפיות CD8 + T תאים יכול להיות מותש מבחינה תפקודית לאורך זמן עם ירידה ייצור ציטוקינים והרג 7,8. כמו כן, בטוח CD8 + T שיבוטים תא לא יכול להרוג, כמו גם עם אחרים שונים ספציפיות TCR 9. לקבלת חסינות מתווכת יעיל תא (CMI), אנטיגנים חייב להיות מזוהה המייצרים לא רק מספרים נאותה להגיב בתאי T, אלא גם חזקים מבחינה פונקציונלית ותאי T להגיב. כאן אנו בוחנים את התא אחוז הרג ספציפי של שני פפטיד ספציפי שיבוטים תא T ב BALB / c עכברים.

Protocol

1. לעורר יעד ספציפיות ההרג מפעיל על ידי חיסון (יום 0) לפני שמתחילים, להחליט על מבצע ספציפי: מערכת היעד. בדוגמה זו של קלאסית assay CTL vivo, נשתמש חיסון פפטיד מטוהרים לעורר ספציפי CD8 + T לתאים. הפפטיד זהה ישמש הדופק התאים …

Discussion

Assay זה יכול להיות שונה כדי לחקור את יכולת שגשוג של תאים, כולל הרחבת המשובטים, כי CFSE מתחלק יחסית שווה בשווה בין הצאצאים 10,11. אפשר גם להשתמש תיוג CFSE לחקור נדידת תאים 6,12, אם כי ישנם תאים אחרים התחקות השיטות עשוי להיות מתאים יותר בהתאם להשערה שלך, tetramers דוגמה פליט…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אני רוצה להודות ביאנקה Mothé, קרלה Oseroff, ומארי צרפת DelGuercio מציגה לי מבחני החיסוני וטיפול העכבר. העבודה במעבדה של ספליטר GA ממומנת על ידי מענק 1-NIH RO1-AI-073558, GLRCE מענק 1-U54-AI-057153, ובארד ארה"ב 3829-06.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
1 mm glass beads   Biospec Products 11079110  
70 μm cell strainer   BD Falcon 352350  
96-well plate   Costar 3799  
Adjulite Incomplete Freund’s Adjuvant   Pacific Immunology n/a  
DMSO   Sigma D-5879  
FBS   GIBCO 16000-077  
FC 500 Flow Cytometer   Beckman Coulter n/a  
Kontes glass tissue grinder   Kontes 885300-0015  
Mini Beadbeater   Biospec Products n/a  
Needle   B-D 305175  
Parafilm “M”   Pechiney Plastic Packaging PM992  
Paraformaldehyde   Electron Microscopy Sciences 157-8  
PBS   GIBCO 10010-023  
PharmLyse lysing reagent   BD Biosciences 555899  
RPMI 1640   GIBCO 11875-093  
Syringe   B-D 309602  
Vybrant CFSE Kit   Invitrogen (Molecular Probes) V12883  

References

  1. Blattman, J. N., Wherry, E. J., Ha, S. J., van der Most, R. G., Ahmed, R. Impact of epitope escape on PD-1 expression and CD8 T-cell exhaustion during chronic infection. J Virol. 83 (9), 4386-4394 (2009).
  2. Jenkins, M. R., Tsun, A., Stinchcombe, J. C., Griffiths, G. M. The strength of T cell receptor signal controls the polarization of cytotoxic machinery to the immunological synapse. Immunity. 31 (4), 621-631 (2009).
  3. Ingulli, E. Tracing tolerance and immunity in vivo by CFSE-labeling of administered cells. Methods Mol Biol. 380, 365-376 (2007).
  4. Durward, M. A., Harms, J., Magnani, D. M., Eskra, L., Splitter, G. A. Discordant Brucella melitensis antigens yield cognate CD8+ T cells in vivo. Infect Immun. 78 (1), 168-176 (2010).
  5. Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J Immunol Methods. 171 (1), 131-137 (1994).
  6. Weston, S. A., Parish, C. R. New fluorescent dyes for lymphocyte migration studies. Analysis by flow cytometry and fluorescence microscopy. J Immunol Methods. 133 (1), 87-97 (1990).
  7. Akondy, R. S. The yellow fever virus vaccine induces a broad and polyfunctional human memory CD8+ T cell response. J Immunol. 183 (12), 7919-7930 (2009).
  8. Wallace, P. K. Tracking antigen-driven responses by flow cytometry: monitoring proliferation by dye dilution. Cytometry A. 73 (11), 1019-1034 (2008).
  9. Labadi, A., Balogh, P. Differential preferences in serosal homing and distribution of peritoneal B-cell subsets revealed by in situ CFSE labeling. Int Immunol. 21 (9), 1047-1056 (2009).
  10. Suffner, J. Dendritic cells support homeostatic expansion of Foxp3+ regulatory T cells in Foxp3.LuciDTR mice. J Immunol. 184 (4), 1810-1820 .

Play Video

Cite This Article
Durward, M., Harms, J., Splitter, G. Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells. J. Vis. Exp. (45), e2250, doi:10.3791/2250 (2010).

View Video