Complementair DNA

Overzicht

Alleen genen die worden getranscribeerd in messenger-RNA (mRNA) zijn actief of worden tot expressie gebracht. Wetenschappers kunnen daarom het mRNA uit cellen extraheren om genexpressie in verschillende cellen en weefsels te bestuderen. De wetenschapper zet mRNA om in complementair DNA (cDNA) via omgekeerde transcriptie. Omdat mRNA geen introns (niet-coderende regio's) en andere regulerende sequenties bevat, stelt cDNA – in tegenstelling tot genomisch DNA – onderzoekers ook in staat om direct de aminozuursequentie te bepalen van het peptide dat door het gen wordt gecodeerd.

cDNA-synthese

cDNA kan op verschillende manieren worden gegenereerd, maar een gebruikelijke manier is om eerst totaal RNA uit cellen te extraheren en vervolgens het mRNA te isoleren van de meer overheersende typen: transfer-RNA (tRNA) en ribosomaal (rRNA). Eukaryotisch mRNA heeft een poly (A) -staart – een reeks adeninenucleotiden – aan het 3'-uiteinde, terwijl andere soorten RNA dat niet hebben. Daarom kan een reeks thyminenucleotiden (oligo-dT's) aan een substraat bevestigd worden, zoals in een ketting van magnetische kralen, om een specifiek basenpaar te vormen met de poly (A) staarten van het mRNA. Terwijl mRNA met een poly (A) -staart wordt opgevangen, worden de andere soorten RNA weggespoeld.

Vervolgens wordt reverse-transcriptase – een DNA-polymerase-enzym uit retrovirussen – gebruikt om cDNA uit het mRNA te genereren. Zoals bij de meeste DNA-polymerasen, kan reverse-transcriptase nucleotiden alleen aan het 3'-uiteinde van een keten toevoegen, hierdoor wordt een poly (T) -primer toegevoegd om te zich aan de poly (A) -staart te binden zodat de cDNA-synthese hier kan beginnen. De cDNA-streng eindigt in een haarspeldlus. Het RNA wordt vervolgens afgebroken – gewoonlijk met alkalibehandeling of RNase-enzymen – waardoor het enkelstrengige cDNA intact blijft.

Een tweede DNA-streng, complementair aan het cDNA, wordt vervolgens gesynthetiseerd door DNA-polymerase – waarbij de haarspeldlus van de eerste cDNA-streng of een gekerfd stuk van het mRNA vaak gebruik wordt als primer.

Het resulterende dubbelstrengse cDNA kan in bacteriële of virale vectoren worden ingevoegd en met behulp van standaard methoden van de moleculaire biologie. Een cDNA-bibliotheek – die alle mRNA's in de cellen, of weefsels, vertegenwoordigt – kan ook worden geconstrueerd voor aanvullend onderzoek.