파지 형질도입: 공여 E.coli에서 수용 E.coli로 암피실린 내성을 전달하는 방법
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Overview
출처: 알렉산더 S. 골드1, 토냐 M. 콜핏스1
1 미생물학학과, 보스턴 대학교 의과대학, 국립 신흥 감염 질병 연구소, 보스턴, MA
트랜스듀션은 박테리아 간의 유전적 교류의 한 형태로, 배니오파지 또는 파지, 독점적으로 대핵 생물을 감염시키는 바이러스의 종류입니다. 이 형태의 DNA 전달은 파지를 통해 박테리아에서 다른 박테리아로, 1951년에 노턴 진더와 조슈아 레더그(Joshua Ledererg)에 의해 발견되었으며, 이들은 이 과정을 “트랜스듀션”(1)이라고 지칭했다. 박테리오파지는 1915년 영국 세균학자 프레드릭 투르트(Frederick Twort)에 의해 처음 발견되었으며, 1917년 프랑스계 캐나다의 미생물학자 펠릭스 데렐(Felix d’Herelle,2)에 의해 독립적으로 발견되었다. 그 이후로, 이러한 파지의 구조와 기능은 널리 특징지어지고 있다 (3), 두 개의 클래스로 이러한 파지를 분할. 이 클래스의 첫 번째는 감염시 숙주 박테리아 내에서 증식하는 lytic 파지, 세균 대사를 방해, 세포를 lysing, 그리고 자손 파지를 해제 (4). 이 항균 활성과 항생제 내성 박테리아의 보급증가의 결과로, 이러한 lytic 파지는 최근 항생제에 대한 대체 치료로 유용함을 입증했다. 이들 클래스의 두 번째는 리액 사이클을 통해 숙주 내에서 증식하거나 게놈이 숙주(그림 1)에 통합되는 정지 상태를 입력할 수 있는 리소겐성 파지이며, 파지 생산능력이 다세대(4)에 유도될 수 있다.
그림 1: 박테리오파지에 의한 숙주 세포의 감염. 꼬리 섬유와 수용체 (보라색) 사이의 상호 작용을 통해 세균 세포 벽에 파지에 의한 흡착. 일단 세포 표면에, 파지는 수축 칼집 (노란색)에 의해 세포벽으로 이동하는 베이스 플레이트 (black)를 사용하여 박테리아 세포에 돌이킬 수 없이 부착된다. 파지 게놈(red)은 세포에 들어가 숙주 세포 게놈에 통합한다.
세균성 트랜스포팅은 자연적으로 발생하는 과정이지만, 현대 기술을 사용하여 실험실 환경에서 유전자를 박테리아로 옮기기 위해 조작되었습니다. 파지와 같은 리존파지의 게놈에 관심 있는 유전자를 삽입함으로써, 이러한 유전자를 박테리아의 게놈으로 옮기고 결과적으로 이러한 세포 내에서 이를 표현할 수 있다. 변형과 같은 유전자 전달의 다른 방법은, 유전자 전달 및 발현을 위해 플라스미드를 사용하지만, 파지 게놈을 받는 박테리아의 것으로 삽입하는 것은 이 박테리아에 새로운 특성을 부여할 뿐만 아니라, 또한 전송된 유전자의 기능을 바꾸기 위하여 세포 환경의 자연적으로 발생하는 돌연변이 및 그밖 요인을 허용합니다.
유도와 같은 수평 유전자 전달의 다른 방법에 비해, 전달은 기증자 및 수령인 세포에 필요한 기준에 상당히 유연하다. 사용되는 파지의 게놈 내부에 들어갈 수 있는 모든 유전 적 원소는 기증자 박테리아의 변형에서 모두 파지에 허용되는 한 받는 사람 박테리아의 변형으로 옮겨질 수 있으며 세포 표면에 필요한 파지 수용체의 발현이 필요합니다. 일단 이 유전자는 기증자 게놈에서 이동하고 파지로 포장되면, 수신자에게 전달될 수 있습니다. 트랜스듀션에 따라 관심 유전자를 포함하는 수신자 박테리아를 선택해야 한다. 이것은 항생 저항을 위해 인코딩하는 유전자의 경우에, 관심의 유전자, 또는 유전자의 본질적인 기능을 표시하기 위하여, FLAG-tag 또는 polyhistidine-tag와 같은 유전 마커의 사용에 의해 행해질 수 있었습니다. 또한 PCR을 사용하여 성공적인 트랜스듀션을 확인할 수 있습니다. 관심 있는 유전자 내의 영역에 프라이머를 사용하고 신호를 긍정적 인 대조군, 관심 유전자가 있는 박테리아 및 음의 대조군, 파지 없이 트랜스유도 반응과 동일한 단계를 겪은 박테리아를 사용한다. 세균성 트랜스포메이션은 분자 생물학에 유용한 도구이지만, 특히 최근 항생제 내성의 부상과 관련하여 박테리아의 진화에 중요한 역할을 하고 있습니다.
본 실험에서, 세균성 트랜스포칭은 P1 박테리오파지(5)를 통해 E.coli의 W3110 균주로부터 항생제 암피실린에 대한 내성을 위한 유전자 인코딩 유전자를 전송하는 데 사용되었다. 이 실험은 두 가지 주요 단계로 구성되었습니다. 첫째, 기증자 균주로부터 암피실린 내성 유전자를 함유하는 P1 파지의 제제. 둘째, P1 파지와의 트랜스듀션에 의한 수신자 균주에 대한 이 유전자의 전달(도 1). 일단 수행되면, 암피실린 저항 유전자의 성공적인 전송은 qPCR에 의해 결정될 수 있었다(도 2). 트랜스포팅이 성공하면 대장균의 J53 균주는 암피실린에 내성이 있으며, qPCR에 의해 검출가능한 이 저항을 부여하는 유전자가 될 것이다. 실패하는 경우에, 암피실린 저항 유전자의 아무 검출도 없을 것이고 ampicillin는 J53 긴장에 대하여 효과적인 항생제로 아직도 작동할 것입니다.
그림 2: qPCR에 의한 성공적인 트랜스듀션확인. 트랜스듀션 반응 및 음성 대조반응으로부터 관심 유전자에 대해 검출된Cq 값을 비교하고, 가사 유전자에 대하여 이러한 값을 정상화함으로써, 세균성 전이 성공했다는 것을 확인할 수 있었다.
Procedure
Applications and Summary
The transfer of genes to and from bacteria by bacteriophage, while a natural process, has proved extremely useful for a multitude of research purposes. While other methods of gene transfer such as transformation and conjugation are possible, transduction uniquely uses bacteriophages; not only allowing for gene integration into the host genome, but also for gene delivery to multiple bacteria that are not susceptible to other methods. This process, while especially useful in the laboratory, has also been used in the recently emerging field of gene therapy, more specifically in alternative gene therapy, a therapeutic strategy that utilizes bacteria to deliver therapeutics to target tissues, many of which are not susceptible to other delivery methods and have much clinical relevance (8,9).
References
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Transcript
Bacteria can adapt quickly to a fast-changing environment by exchanging genetic material and one way they can do this is via transduction, the exchange of genetic material mediated by bacterial viruses. A bacteriophage, often abbreviated to phage, is a type of virus that infects bacteria by first attaching to the surface of the host and then injecting its DNA into the bacterial cell. It then degrades the host cell’s own DNA and replicates its viral genome, whilst hijacking the cell’s machinery to synthesize many copies of its proteins. These phage proteins then self-assemble and package the phage genomes to form multiple progeny. However, due to the low fidelity of the DNA packaging mechanism, occasionally, the phage packages fragments of bacterial DNA into the phage capsid. After inducing the lysis of the host, the phage progeny are released and, once such a phage infects another host cell, it transfers the DNA fragment of its previous host. This can then recombine and become permanently incorporated into the new host’s chromosome, thereby mediating gene transfer between the two bacteria.
To carry out phage transduction in the laboratory requires a donor strain that contains a gene of interest, a recipient strain that lacks it, a phage that can infect both the strains, and a method to select the transduced bacteria. In most cases, this will be a selective solid growth media that supports the growth of transduced bacteria but inhibits the growth of non-transduced ones. To begin, the donor strain that contains the gene of interest is cultured in a liquid growth medium. When all the bacteria are actively dividing in the log phase of their growth, the culture is inoculated with the target phage. After three to four hours of incubation, when nearly all the bacteria have lysed and released the phage particles, the donor phage lysate is inoculated into a freshly grown culture of the recipient bacterial strain. After a brief incubation of one hour, the culture should now contain a mixture of transduced and non-transduced bacterial cells and this is screened for the transduced cells by spreading a fraction of the suspension onto an appropriate selective solid growth media. Upon further incubation, the transduced cells should grow and multiply to yield visible colonies. These colonies can then be selected for further analysis using a variety of methods to further confirm successful transduction, such as colony PCR, DNA sequencing, or quantitative PCR.
Before starting the procedure, put on any appropriate personal protective equipment, including a lab coat and gloves. Next, sterilize the workspace with 70% ethanol and wipe down the surface.
After this, prepare three one-milliliter aliquots of LB salt solution. Now, prepare a donor strain culture by adding 100 microliters of E. coli to a 15 milliliter conical vial containing five milliliters of LB growth medium with 500 micrograms of ampicillin. Then, grow the culture overnight at 37 degrees Celsius with aeration and shaking at 220 rpm. The next day, wipe down the bench top with 70% ethanol before removing the culture from the shaking incubator. Next, dilute the overnight culture one to 100 by adding 10 microliters of donor strain to 990 microliters of fresh LB supplemented with salt solution.
Allow the bacterial dilution to grow at 37 degrees Celsius for two hours with aeration and shaking at 220 rpm. Once the cells have reached early log phase, remove the culture from the incubator, add 40 microliters of P1 phage to the culture and incubate again. Continue to monitor the cells for one to three hours until the culture has lysed. Next, add 50 to 100 microliters of chloroform to the lysate and mix by vortexing. Then, centrifuge the lysate to remove debris and transfer the supernatant to a fresh tube. Add a few drops of chloroform to the supernatant and store it at four degrees Celsius for no more than one day.
To begin the transduction procedure, obtain a one milliliter culture of recipient strain. Next, transfer 100 microliters of donor phage lysate into a 1.5 milliliter microcentrifuge tube and incubate it at 37 degrees Celsius with the cap open for 30 minutes to allow any remaining chloroform to evaporate. While the donor phage lysate incubates, pellet the recipient strain cells via gentle centrifugation. Discard the supernatant and resuspend the cell pellet in 300 microliters of fresh LB containing 100 millimolar magnesium sulfate and five millimolar calcium chloride.
Next, set up the transduction reaction by combining 100 microliters of the recipient strain and 100 microliters of the donor phage lysate in a microcentrifuge tube. Then, set up the negative control by combining 100 microliters of the recipient strain and 100 microliters of the LB with magnesium sulfate and calcium chloride. After incubation, add 200 microliters of one molar sodium citrate and one milliliter of LB to both tubes, and mix by gently pipetting up and down. Then, after the tubes have been incubated for an hour, gently pellet the cells via centrifugation.
After centrifuging, discard the supernatant and resuspend the pelleted cells in 100 microliters of LB with 100 millimolar sodium citrate. Vortex the solutions and pipette the entire transduced sample onto an LB agar plate with 1X ampicillin. Finally, pipette the entire volume of the negative control cell mixture onto an LB agar plate without ampicillin. After incubating the plates overnight at 37 degrees Celsius, use a sterile pipette tip to pick three to four colonies from the transduction plate and streak them onto a new LB agar plate containing 1X ampicillin and 100 microliters of one molar sodium citrate. Repeat this plating method for the negative control on another LB agar plate containing only 100 microliters of one molar sodium citrate. Then, incubate the plates at 37 degrees Celsius overnight to allow colonies free of phage to grow.
The next day, wipe down the bench top with 70% ethanol before removing your plates from the incubator. Using a sterile pipette tip, pick three colonies from the transduction plate and add them each to a separate tube containing five milliliters of LB media. Then, select three colonies from the negative control plate and add them to another tube containing five milliliters of LB media. Grow the cultures overnight at 37 degrees Celsius with aeration and shaking at 220 rpm. After sterilizing the bench top as previously demonstrated, use a DNA miniprep kit to isolate DNA from 4.5 milliliters of each culture according to the manufacturer’s instructions. Then, elute the DNA with 35 microliters of nuclease-free water and measure the resulting concentration by lab spectrophotometer. Finally, prepare glycerol stocks by adding the remaining 0.5 milliliters of both bacterial solutions to 0.5 milliliters of 100% glycerol.
To confirm transduction, first prepare two qPCR master mixes for 24 qPCR reactions. For the first master mix, add 150 microliters of qPCR buffer mix to a microcentrifuge tube and 12 microliters each of a forward and reverse primer designed to amplify the ampicillin resistance gene. Next, prepare a second qPCR master mix by adding 150 microliters of qPCR master mix to a microcentrifuge tube and then adding 12 microliters each of a forward primer and reverse primer designed to amplify a housekeeping gene.
For each qPCR reaction, combine 100 micrograms of experimental DNA from each reaction with 14.5 microliters of qPCR master mix. Now, prepare the remaining reactions as previously demonstrated. Transfer the reactions to a thermocycler preheated to 94 degrees Celsius and then initiate the program. Finally, use the cycle quantification, or Cq, values generated by qPCR to calculate the normalized transduction efficiency of the ampicillin resistance gene.
The cycle quantitation, or Cq, values for the genes of interest were tabulated for each of the negative controls and transduced samples. Low Cq values, typically below 29 cycles, like the transduced samples in this example indicate high amounts of the target sequence.
A housekeeping gene, also tabulated here, is used as a loading control to normalize the amount of DNA in each reaction and as a positive control to ensure the qPCR is working. Provided the same amounts of the housekeeping gene are loaded, it is found at relatively the same rate in each sample.
Next, to calculate the delta Cq value for each sample, subtract the Cq value of the housekeeping gene for each sample from the Cq value of its corresponding target gene. For example, the delta Cq of the first negative control is 13.54. Then, use this value to calculate the normalized transduction efficiency of each sample using the formula shown here. Finally, the average normalized transduction efficiency for each sample group can be calculated.