Özet

מטריצת קרום מרתף צבירת תאים עטופה לחקר היווצרות רקמת טחול מורין

Published: June 28, 2024
doi:

Özet

מאמר זה מתאר פרוטוקול לצבירה ומעטפת של תאי טחול בתוך מטריצת קרום מרתף מוצקה למחצה. מבני מטריצת קרום מרתף יכולים לשמש בתרבית תלת ממדית לחקר התפתחות אורגנואידים, או למחקרי השתלות in vivo והתחדשות רקמות.

Abstract

הטחול הוא איבר חיסוני הממלא תפקיד מפתח בתגובות חיסוניות המועברות בדם. אובדן אנטומי או פונקציונלי של רקמה זו מגביר את הרגישות לזיהומים חמורים בדם ואלח דם. השתלה אוטומטית של פרוסות טחול שימשה קלינית להחלפת רקמות שאבדו ולשיקום תפקוד מערכת החיסון. עם זאת, המנגנון המניע התחדשות חזקה ומתפקדת אימונולוגית של רקמת הטחול לא הובהר במלואו. כאן, אנו שואפים לפתח שיטה לצבירה ומעטפת של תאי טחול בתוך מטריצה מוצקה למחצה על מנת לחקור את הדרישות התאיות להיווצרות רקמת הטחול. מבני תאים עטופים במטריצת קרום מרתף מקובלים הן על תרבית רקמת מבחנה של אורגנואידים תלת מימדיים והן על השתלה תחת קפסולת הכליה כדי להעריך ישירות את היווצרות רקמת vivo . על ידי מניפולציה של תאי הקלט לצורך צבירה ואנקפסולציה, אנו מראים כי תאי סטרומה ילודים PDGFRβ+MAdCAM-1 שמקורם בשתלים נדרשים להתחדשות רקמת הטחול תחת מודלים של השתלות בעלי חיים.

Introduction

קרע טראומטי של הטחול והופעת גושים טחול מרובים בגוף היה אחד הסימנים הראשונים לכך שרקמת הטחול הייתה בעלת יכולת התחדשות 1,2. השתלות אוטומטיות של טחול הוכנסו מאוחר יותר למרפאה כדי לשמר את רקמת הטחול בחולים הזקוקים לכריתת טחול דחופה3. עם זאת, למרות היותו חלק מהפרקטיקה הקלינית במשך עשרות שנים, מעט מאוד ידוע על האופן שבו הטחול מתחדש. מודלים להשתלות בעלי חיים סיפקו תובנה לגבי פרמטרים רבים של התחדשות הטחול ותפקוד מערכת החיסון 4,5. בפרט, שינויים ניסיוניים בשיטת הכנת השתל אפשרו להתחדשות רקמות להיחקר בפירוט רב יותר ברמה התאית והמולקולרית.

השתלות המערבות פרוסות טחול שלמות עוברות שלב של נמק המוני לפני שמבנה טחול חדש נבנה מחדש6. השלב הראשוני של נמק השתל מצביע על כך שרוב הרקמה המושתלת מורכבת בעיקר מתאי דם אדומים ולבנים והיא מיותרת להתחדשות הטחול. זה נחקר באופן ניסיוני על ידי אי הכללת תאים hematopoietic משתלי טחול לפני ההשתלה תחת כמוסת הכליה עכבר. כאן, החלק שאינו לויקוציטים / לא אריתרוציטים של הטחול, הכולל תאי סטרומה ואנדותל, הוכח כמספיק כדי לגרום להיווצרות רקמת דה נובו 7. רקמת סטרומה של הטחול יכולה להיות מעובדת עוד יותר לתרחיף של תא יחיד, מה שיאפשר שימוש בטכנולוגיות מיון תאים כדי לתפעל את הרכב השתל התאי. על ידי הסרה סלקטיבית של סוגי תאים מועמדים, זוהו שתי אוכלוסיות תאי סטרומה CD45-TER-119 שהיו חיוניות לפיתוח שתלים: אוכלוסיית תאים דמוית אנדותל CD31+CD105+MAdCAM-1+ ואוכלוסיית תאים מזנכימליים PDGFRβ+ מוגדרת באופן רחב יותר8.

בניית שתלים מתאי הטחול משתנה מבחינת חומרי תמיכה ותהליכי העמסת תאים. טחול מהונדס רקמות הוכנו בעבר על ידי העמסת יחידות ספלניות על פיגום פולימרי חומצה פוליגליקולית/חומצה לקטיתפולי-L 5,9. באופן מעניין, תאי סטרומה של הטחול שנספגו בספוג קולגן לא הצליחו להיקלט, בעוד שתאי סטרומה שהצטברו והועמסו על יריעת קולגן סייעו להתחדשות הטחול8. השעיה של תאי סטרומה בטחול בתוך מטריצת מטריג’ל הוכחה גם כגורמת לצבירת תאים בתנאי תרבית תלת ממדית10. עם זאת, שיטה זו לא נבדקה לשימוש במודלים להשתלה. המטרה הכוללת של הפרוטוקול הנוכחי היא לצבור ולעטוף בכוח תאי סטרומה של הטחול ישירות בתוך מטריצת קרום המרתף, אשר לאחר מכן יכולים להיות מועברים למערכת תלת-ממדית של תרביות רקמה חוץ גופית או לשמש ככלי להשתלות מודל של בעלי חיים (איור משלים 1).

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים נערכו על פי פרוטוקולים ניסיוניים שאושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים באוניברסיטת קווינסלנד (UQBR/079/19). 1. איסוף רקמות והכנת תאי סטרומה יש להרדים עכברים תורמי יילודים בני 0.5-1.5 יום ו/או נקבה BALB/c על ידי השראת היפותרמיה על ידי עטיפת בעלי חיים ?…

Representative Results

צבירת תאים חשובה לקידום מגע ואיתות בין תאים. עטיפת צברי תאים בתוך מטריצת קרום המרתף תמכה בשתי התרביות התלת-ממדיות ליצירת אורגנואידים של רקמת מבחנה והקלה על העברה מכנית של תאים לתוך קפסולת הכליה להשתלת שתל. כדי לבסס מבנים אלה, מטריצת קרום המרתף נשמרה תחילה במצב נוזלי בתנאים קרים כקרח. ?…

Discussion

הצבירה של תאי טחול בילודים בתוך תווך מוצק למחצה מייצגת שיטה בת קיימא ליצירת מבני טחול. פרוטוקולים דומים מבוססי ממברנות מרתף שימשו ליזום תרביות טחול תלת ממדיות10. כאן, אנו מראים כי מבני הטחול מתאימים באותה מידה למערכות תרבית אורגנואידים במבחנה , כמו גם למודלים של השתלת in …

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי המועצה הלאומית לבריאות ומחקר רפואי של אוסטרליה (#GNT1078247).

Materials

96 Well Polypropylene 1.2 mL Cluster Tubes Corning CLS4401 For placing inside a 14 ml conical tube
B-mercaptoethanol Gibco 21985023 Stock 55 mM, use at 50 uM
Collagenase D Roche 11088858001
Collagenase IV Sigma-Aldrich C5138 From Clostridium histolyticum
Deoxyribonuclease I (DNase I) Sigma-Aldrich D4513 Deoxyribonuclease I from bovine pancreas,Type II-S, lyophilized powder, Protein ≥80 %, ≥2,000 units/mg protein
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) Sigma-Aldrich D5796 4500 mg/L Glucose, L-Glutamine, and Sodium Bicarbonate, without Sodium Pyruvate, Liquid. Sterile Filtered.
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich D8537 Without calcium chloride and magnesium chloride, sterile-filtered
Eclipse 200 μl Pipette Tips Labcon 1030-260-000 Bevel Point
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 26140-079 Lot# 1382243
GlutaMAX Gibco 35050061 Stock 100X, use at 1X
Matrigel Corning 354263 Matrigel matrix basement membrane High Concentration, Lot# 7330186
MEM Non-essential Amino Acids Gibco 11140076 Stock 100X, use at 1X
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140122 Stock 10,000 units/ml Penicillin, 10,000 ug/ml Streptomycin
Reversible Cell Strainer STEMCELL Technologies 27216 70 μm
Ring Tweezers NAPOX A-26 Ring size: 3 mm
Rock Inhibitor (Y-27632) MedChemExpres HY-10071
Thermofisher Heraeus Megafuge 40R Centrifuge Thermofisher Acceleration and deceleration speeds were set to 8
Ultra Fine Tweezers EMS 78340-51S Style 51S. Antimagnetic/anti-acid SA low carbon austenitic steel tweezers are corrosion resistant. Anti-glare satin finish.
Vicryl 5/0 Suture Ligapak Reel Ethicon J283G
Wiretrol II Long Wire Plunger Drummond 5-000-2002-L Stainless Steel Plunger, 25 & 50 μL/WRTL II, Long 
Wound Clip Applier MikRon 427630
Wound Clips MikRon 427631 9 mm

Referanslar

  1. Jarcho, S., Andersen, D. Traumatic autotransplantation of splenic tissue. American Journal of Pathology. 15 (5), 527-546 (1939).
  2. Storsteen, K. A., ReMine, W. Rupture of the spleen with splenic implants: splenosis. Annals of Surgery. 137 (4), 551-557 (1953).
  3. Mizrahi, S. Posttraumatic autotransplantation of spleen tissue. Archives of Surgery. 124 (7), 863 (1989).
  4. Miko, I., et al. Spleen autotransplantation. Morphological and functional follow-up after spleen autotransplantation in mice: A research summary. Microsurgery. 27 (4), 312-316 (2007).
  5. Grikscheit, T. C., et al. Tissue-engineered spleen protects against overwhelming Pneumococcal sepsis in a rodent model. Journal of Surgical Research. 149 (2), 214-218 (2008).
  6. Pabst, R., Westermann, J., Rothkotter, H. Immunoarchitecture of regenerated splenic and lymph node transplants. International Review of Cytology. 128, 215-260 (1991).
  7. Tan, J. K. H., Watanabe, T. Murine spleen tissue regeneration from neonatal spleen capsule requires lymphotoxin priming of stromal cells. The Journal of Immunology. 193 (3), 1194-1203 (2014).
  8. Tan, J. K. H., Watanabe, T. Stromal cell subsets directing neonatal spleen regeneration. Scientific Reports. 7 (1), 40401 (2017).
  9. Gee, K., et al. Spleen organoid units generate functional human and mouse tissue-engineered spleen in a murine model. Tissue Engineering Part A. 26 (7-8), 411-418 (2020).
  10. Ueno, Y., et al. Transcription factor Tlx1 marks a subset of lymphoid tissue organizer-like mesenchymal progenitor cells in the neonatal spleen. Scientific Reports. 9 (1), 20408 (2019).
  11. . Online data repository: Matrigel encapsulated cell aggregation for investigating murine spleen tissue formation Available from: https://osf.io/ehrbw/?view_only=7d6a8e05c84144d3a12d36ffe7f94f01 (2023)

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Tourle, K., Rucinski, A., Grainger, A., Limnios, I. J., Gonzalez Ruiz, M., Tan, J. K. Basement Membrane Matrix Encapsulated Cell Aggregation for Investigating Murine Spleen Tissue Formation. J. Vis. Exp. (208), e66682, doi:10.3791/66682 (2024).

View Video