تنقية تقارب بروتين 6X-his-tagged باستخدام نظام كروماتوغرافيا سائل سريع البروتين

تتوفر العديد من الاستراتيجيات لفهم البيولوجيا الخلوية. يتضمن أحد الأساليب استراتيجية من أعلى إلى أسفل ، حيث يتم إدخال طفرات جينية في الجين ، يليها تقييم التغيرات المظهرية الناتجة في كائن حي نموذجي. على العكس من ذلك ، يستلزم النهج الاختزالي التوضيح الأولي للآليات الجزيئية والوظائف الأنزيمية لبروتين معين ، مصحوبا بتوصيف تفاعلاته مع المكونات الخلوية الأخرى. بعد ذلك ، يتم تقييم تأثير هذا البروتين على المسار البيولوجي. على الرغم من أن كل نهج بحثي يمتلك مزاياه وقيوده المتأصلة ، إلا أن تحقيق فهم شامل للمسار البيولوجي يتطلب تحقيقات متعددة التخصصات.

نظرا لأن الحمض النووي هو المخطط الجيني للحياة ، فإن فهم آليات تكرار الحمض النووي وصيانة الجينوم كان مجالا ذا اهتمام نشط لأكثر من سبعة عقود. أسفرت الدراسات في مجال تكرار الحمض النووي عن بيانات وفيرة تتعلق بالهياكل الفردية ووظائف العديد من بروتينات النسخ المتماثل. هذه الاستفسارات ، التي تشمل الجوانب الميكانيكية وفحوصات النشاط الكيميائي الحيوي ، أصبحت ممكنة من خلال تنقية هذه البروتينات ، مما مكن من فحصها الدقيق في بيئة في المختبر . وبالتالي ، تظهر تنقية البروتين كتقنية لا غنى عنها وفي كل مكان في غالبية المساعي البحثية الموجهة نحو كشف الرؤى الميكانيكية في تكرار الحمض النووي.

تقدم هذه المقالة منهجية لعزل بروتين تكرار الحمض النووي الموسوم ب 6X-histidine ، والذي تم التعبير عنه بشكل مفرط في الخلايا البكتيرية. البروتين محل الاهتمام هو endonuclease endonuclease 1 (FEN1) ، وهو نوكلياز خاص بالبنية يلعب دورا محوريا في تكرار الشريط المتأخر وهو أيضا مشارك مهم في مسارات إصلاح الحمض النووي مثل إصلاح استئصال القاعدة (BER) ^1،2،3. تتمثل الوظيفة الأساسية ل FEN1 في الالتصاق بقاعدة بنية رفرف نازحة 5 بوصات ، وهو وسيط ينشأ أثناء تكرار الحمض النووي أو BER. في البداية ، اقترحت التحقيقات الكيميائية الحيوية التي تقيم النشاط الأنزيمي ل FEN1 آلية “تتبع” ، حيث يتعرف النيوكلياز على الطرف الحر 5′-فوسفات لهيكل السديلة ثم يتبع على طول السديلة إلى قاعدتها قبل شقها⁴. كشفت الأبحاث اللاحقة أن FEN1 يعمل عبر آلية “خيوط” ، حيث يرتبط أولا بقاعدة السديلة ثم يخيط الطرف الحر 5 بوصات من خلال موقعه النشط قبل الانقسام (الشكل 1) ⁵. وقد سهلت القدرة على الإفراط في التعبير عن FEN1 المؤتلف وعزله هذه الاختراقات ، مما مكن الباحثين من توظيفه في التحقيقات البيوكيميائية والهيكلية.

كروماتوغرافيا التقارب هي طريقة فصل شائعة الاستخدام لتنقية الحمض النووي. تستخدم هذه التقنية تقارب الارتباط العكسي للبروتينات المستهدفة نحو الروابط المثبتة على الراتنج لحبس البروتين محل الاهتمام على وجه التحديد. واحدة من أكثر الصلات الحيوية استخداما هي التفاعل القوي بين الأحماض الأمينية والهيستيدين وأيونات المعادن مثل النيكل والكوبالت ، وبالتالي ، يمكن التقاطها على راتنج مشحون ب Ni²⁺ أو Co²⁺.

غالبا ما يتم دمج تسلسل الحمض النووي الذي يشفر سلسلة من 6-9 بقايا هستيدين (His) في بنية البلازميد التي تشفر البروتين محل الاهتمام (إما في N-terminus أو C-terminus) ، مع تمييز البروتين بعلامة 6X-His-أو علامة poly-His . يمكن بعد ذلك تنقية البروتين الموسوم His-Magazine بسهولة عن طريق كروماتوغرافيا التقارب المعدني المجمدة (IMAC) ، وهو نوع فرعي من كروماتوغرافيا التقارب حيث تلتقط أيونات المعادن الموجودة على الراتنج البروتينات بعلامة تقارب ، والتي يمكن استخلاصها لاحقا باستخدام عوامل الشطف المناسبة. يمكن تجميد أيونات الفلزات الانتقالية مثل Ni²⁺ و Co²⁺ على مصفوفات هلام الأغاروز أو السيليكا المشتقة من مجموعات N و N و N’-tris- (كربوكسي ميثيل) – إيثيلين ديامين أو حمض النيتريلوتريسيتيك (NTA)⁶.

من المعروف أن الروابط المعدنية قوية ضد التدهور بسبب العوامل الفيزيائية والكيميائية والبيولوجية وتحتفظ بهذه الميزة على الأنواع الأخرى من الروابط ^6,7. بالإضافة إلى ذلك ، فإن علامة His-tag هي علامة صغيرة نسبيا ولا تؤثر بشكل كبير على بنية البروتين أو وظيفته⁷. ومع ذلك ، في نظام التعبير البكتيري ، يكون للعديد من البروتينات المعبر عنها كروموسوميا ميل نحو أيونات المعادن وقد تتكاثر مع البروتين المستهدف. النيكل والكوبالت هما أيونات الفلزات النموذجية المستخدمة في مصفوفات IMAC. يشيع استخدام راتنج Ni-NTA والراتنج القائم على الكوبالت TALON لتنقية البروتينات الموسومة به.

ني-NTA مقابل تالون
يتم تجميد أيونات المعادن الخاصة بكل من Ni-NTA و TALON على الراتنج من خلال روابط NTA. يعتقد أن Ni-NTA تتمتع بقدرة ربط أعلى ، حيث تربط ما يصل إلى 100 مجم / مل من البروتين. يمكن أن يؤدي ذلك إلى زيادة إنتاج البروتين ، مع التحذير من أن البروتينات الملوثة قد يتم تنقيتها بشكل مشترك. في المقابل ، يتمتع الراتنج بخصوصية ربط أعلى تجاه البروتينات الموسومة به وقد يكون قادرا على إنتاج أجزاء من درجة نقاء أعلى. في هذه الدراسة ، نهدف إلى مقارنة كفاءة تنقية كلا الراتنجين باستخدام نظام كروماتوغرافيا سائل البروتين السريع الآلي المشار إليه ، ونظام NGC (انظر جدول المواد).

المخازن المؤقتة والتوافق
المخازن المؤقتة مطلوبة أثناء تنقية البروتين لتحلل الخلايا ، وإعداد العينات ، وتوازن الراتنج ، وشطف البروتين الذي تم التقاطه من الراتنج. المخازن المؤقتة Tris و MOPS و HEPES حتى تركيز 100 مللي متر هي المخازن المؤقتة المتوافقة المعروفة لراتنج Ni-NTA. غالبا ما تشتمل المخازن المؤقتة على عوامل اختزال لمنع أكسدة البروتين وتراكم البروتين. ومع ذلك ، فوق حد العتبة ، يمكن أن تؤدي عوامل الاختزال إلى تجريد راتنج أيونات المعادن. التركيز الموصى به لعوامل الاختزال مثل بيتا ميركابتوإيثانول (BME) أو ديثيوثريتول (DTT) أقل من 1 mM للراتنجات القائمة على النيكل والكوبالت المذكورة أعلاه.

المخازن المؤقتة لتنقية hFEN1 هي مخازن Tris التي تحتوي على كلوريد الصوديوم ، BME ، فلوريد فينيل ميثيل سلفونيل (PMSF) ، EDTA ، والجلسرين. يحافظ كلوريد الصوديوم على البروتين في شكل قابل للذوبان ويعطل التفاعلات الجزيئية مثل ارتباط الحمض النووي. يقلل BME من البروتينات المؤكسدة وبالتالي يمنع تراكم البروتين. PMSF) هو مثبط للبروتياز يمنع تدهور البروتين المستهدف بوساطة البروتياز. يزيل EDTA الكاتيونات ثنائية التكافؤ من العينة ، مما يمنع وصولها إلى النيوكليازات والبروتياز. الجلسرين يعزز استقرار البروتين في شكل مائي. بالإضافة إلى ذلك ، يحتوي المخزن المؤقت للتحلل على أقراص مثبطة كاملة للبروتياز لضمان أقصى حماية للبروتين المستهدف من تحلل البروتياز أثناء تحلل الخلية. تحتوي مخازن التوازن والشطف على إيميدازول ، حيث يحتوي محلول الشطف على كميات أعلى للإيميدازول لإزاحة البروتين المرتبط من الراتنج أثناء الشطف.

نظام كروماتوغرافيا الجيل التالي (NGC)
يستخدم نظام كروماتوغرافيا الضغط المتوسط الآلي هذا المصمم لكروماتوغرافيا البروتين السائل سريع التدفق (FPLC) مضختين لضخ مخزنين مؤقتين مختلفين في وقت واحد وهو قادر على حقن مجموعة واسعة من أحجام العينات من 250 ميكرولتر إلى 100 مل. حلقة العينة (المعروفة باسم Dynaloop في هذا النظام) ، تجعل من الممكن حقن أحجام عينات أكبر. يمكن تشغيل النظام باستخدام برنامج Chromlab ، مما يسهل إنشاء طريقة مخصصة ، والتلاعب في عمليات التنقية ، وتحليل قمم الأشعة فوق البنفسجية وكسور البروتين.