Purificazione per affinità di una proteina marcata 6X-His-Tagged utilizzando un sistema di cromatografia liquida proteica veloce

Sono disponibili numerose strategie per comprendere la biologia cellulare. Un approccio prevede una strategia top-down, in cui le mutazioni genetiche vengono introdotte in un gene, seguite dalla valutazione dei cambiamenti fenotipici risultanti in un organismo modello. Al contrario, un approccio riduzionista comporta la delucidazione iniziale dei meccanismi molecolari e delle funzioni enzimatiche di una particolare proteina, accompagnata dalla caratterizzazione delle sue interazioni con altri componenti cellulari. Successivamente, viene valutato l’impatto di questa proteina su un percorso biologico. Sebbene ogni approccio di ricerca possieda i suoi vantaggi e limiti intrinseci, il raggiungimento di una comprensione completa di un percorso biologico richiede indagini interdisciplinari.

Poiché il DNA è il modello genetico della vita, la comprensione dei meccanismi di duplicazione del DNA e del mantenimento del genoma è stata un’area di interesse attivo per oltre sette decenni. Gli studi nel campo della replicazione del DNA hanno prodotto numerosi dati riguardanti le singole strutture e funzioni di numerose proteine di replicazione. Queste indagini, che comprendono aspetti meccanicistici e saggi di attività biochimica, sono state rese possibili attraverso la purificazione di queste proteine, consentendo il loro esame meticoloso in un ambiente in vitro . Di conseguenza, la purificazione delle proteine emerge come una tecnica indispensabile e onnipresente nella maggior parte degli sforzi di ricerca volti a svelare intuizioni meccanicistiche sulla replicazione del DNA.

Questo articolo presenta una metodologia per isolare una proteina di replicazione del DNA marcata con 6X-istidina, che è stata sovraespressa nelle cellule batteriche. La proteina di interesse è l’endonucleasi 1 del lembo umano (FEN1), una nucleasi struttura-specifica che svolge un ruolo fondamentale nella replicazione del filamento ritardato ed è anche un partecipante critico nei percorsi di riparazione del DNA come la riparazione per escissione di basi (BER)^1,2,3. La funzione principale di FEN1 è quella di scindere alla base di una struttura di lembo spostata di 5′, un intermedio che si verifica durante la replicazione del DNA o BER. Inizialmente, le indagini biochimiche che valutavano l’attività enzimatica di FEN1 suggerivano un meccanismo di “tracciamento”, in cui la nucleasi riconosceva l’estremità libera del 5′-fosfato di una struttura di lembo e poi seguiva lungo il lembo fino alla sua base prima di scinderlo⁴. Ricerche successive hanno rivelato che FEN1 funziona tramite un meccanismo di “filettatura”, in cui prima si lega alla base del lembo e poi infila l’estremità libera 5′ attraverso il suo sito attivo prima della scissione (Figura 1)⁵. La capacità di sovraesprimere e isolare FEN1 ricombinante ha facilitato queste scoperte, consentendo ai ricercatori di impiegarlo in indagini biochimiche e strutturali.

La cromatografia di affinità è un metodo di separazione comunemente usato per purificare il DNA. Questa tecnica utilizza l’affinità di legame reversibile delle proteine bersaglio verso i ligandi immobilizzati su una resina per intrappolare specificamente la proteina di interesse. Una delle bio-affinità più utilizzate è la robusta interazione tra l’amminoacido, l’istidina e gli ioni metallici come il nichel e il cobalto e, quindi, può essere catturata su una resina caricata con Ni²⁺ o Co²⁺.

La sequenza di DNA che codifica una stringa di 6-9 residui di istidina (His) è spesso incorporata nel costrutto plasmidico che codifica la proteina di interesse (sia all’N-terminale che al C-terminale), marcando la proteina con un tag 6X-His-S o un tag poly-His. La proteina marcata con His-taged può quindi essere facilmente purificata mediante cromatografia di affinità con metalli immobilizzati (IMAC), un sottotipo di cromatografia di affinità in cui gli ioni metallici sulla resina catturano le proteine con un tag di affinità, che possono essere successivamente eluite utilizzando agenti di eluizione appropriati. Gli ioni dei metalli di transizione come Ni²⁺ e Co²⁺ possono essere immobilizzati su matrici di agarosio o gel di silice derivate dai gruppi⁶ di N,N,N,N’-tris-(carbossimetil)-etilendiammina o acido nitrilotriacetico (NTA).

I leganti metallici sono noti per essere robusti contro la degradazione da fattori fisici, chimici e biologici e mantengono questo vantaggio rispetto ad altri tipi di leganti ^6,7. Inoltre, l’His-tag è un tag relativamente piccolo e non influisce in modo significativo sulla struttura o sulla funzione delle proteine⁷. Tuttavia, in un sistema di espressione batterica, molte proteine espresse cromosomicamente hanno un’affinità verso gli ioni metallici e possono co-purificarsi con la proteina bersaglio. Il nichel e il cobalto sono gli ioni metallici tipici utilizzati nelle matrici IMAC. La resina Ni-NTA e la resina a base di cobalto TALON sono comunemente utilizzate per la purificazione delle proteine marcate con His.

Ni-NTA contro TALON
I rispettivi ioni metallici di Ni-NTA e TALON sono immobilizzati sulla resina attraverso leganti NTA. Si ritiene che il Ni-NTA abbia una maggiore capacità di legame, legando fino a 100 mg/mL di proteine. Ciò può comportare una maggiore resa proteica, con l’avvertenza che le proteine contaminanti possono essere co-purificate. Al contrario, la resina ha una maggiore specificità di legame verso le proteine marcate con His-taged e potrebbe essere in grado di produrre frazioni di purezza superiore. In questo studio, miriamo a confrontare l’efficienza di purificazione di entrambe le resine utilizzando il sistema automatizzato di cromatografia liquida di proteine veloci di riferimento, il sistema NGC (vedi la Tabella dei materiali).

Buffer e compatibilità
I tamponi sono necessari durante la purificazione delle proteine per la lisi cellulare, la preparazione del campione, l’equilibrio della resina e l’eluizione della proteina catturata dalla resina. I tamponi Tris, MOPS e HEPES fino a una concentrazione di 100 mM sono i tamponi compatibili noti per la resina Ni-NTA. I tamponi spesso includono agenti riducenti per prevenire l’ossidazione delle proteine e l’aggregazione proteica. Tuttavia, al di sopra di un limite di soglia, gli agenti riducenti potrebbero privare la resina degli ioni metallici. La concentrazione raccomandata di agenti riducenti come il beta-mercaptoetanolo (BME) o il ditiotreitolo (DTT) è inferiore a 1 mM per le resine a base di nichel e cobalto sopra menzionate.

I tamponi per la purificazione di hFEN1 sono tamponi Tris contenenti NaCl, BME, fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF), EDTA e glicerolo. NaCl mantiene la proteina in forma solubile e interrompe le interazioni molecolari come il legame con il DNA. Il BME riduce le proteine ossidate e quindi previene l’aggregazione proteica. PMSF) è un inibitore della proteasi che previene la degradazione mediata dalla proteasi della proteina bersaglio. L’EDTA elimina i cationi bivalenti dal campione, impedendone l’accesso a nucleasi e proteasi. Il glicerolo migliora la stabilità della proteina in forma acquosa. Inoltre, il tampone di lisi contiene compresse complete di inibitori della proteasi per garantire la massima protezione della proteina bersaglio dalla degradazione delle proteasi durante la lisi cellulare. I tamponi di equilibratura ed eluizione contengono imidazolo, mentre il tampone di eluizione contiene quantità maggiori per l’imidazolo per spostare la proteina legata dalla resina durante l’eluizione.

Sistema di cromatografia di nuova generazione (NGC)
Questo sistema automatizzato di cromatografia a media pressione progettato per la cromatografia liquida di proteine a flusso rapido (FPLC) utilizza due pompe per pompare contemporaneamente due diversi tamponi ed è in grado di iniettare un’ampia gamma di volumi di campione da 250 μl a 100 mL. Il sample loop (noto come Dynaloop in questo sistema), consente di iniettare volumi di campione maggiori. Il sistema può essere utilizzato utilizzando il software Chromlab, che facilita la creazione di metodi personalizzati, la manipolazione di cicli di purificazione e l’analisi dei picchi UV e delle frazioni proteiche.