Здесь мы предлагаем три различных метода повреждения сенсорных волокон, иннервирующих роговицу. Эти методы облегчают изучение регенерации аксонов у мышей. Эти три метода, которые могут быть адаптированы к другим животным моделям, идеально подходят для изучения физиологии и регенерации иннервации роговицы.
Роговица представляет собой прозрачную ткань, которая покрывает глаз и имеет решающее значение для четкого зрения. Это самая иннервируемая ткань в организме. Эта иннервация обеспечивает чувствительность и трофическую функцию глаза и способствует сохранению целостности роговицы. Патологическое нарушение этой иннервации называется нейротрофическим кератитом. Это может быть вызвано травмой глаза, хирургическим вмешательством или заболеванием. В этом исследовании мы предлагаем три различных протокола для нанесения повреждений иннервации способами, которые повторяют три типа случаев, обычно встречающихся в клинике.
Первый способ заключается в том, чтобы сделать шлифовку эпителия глазным бором. Это включает в себя удаление эпителиального слоя, свободных нервных окончаний и суббазального сплетения способом, аналогичным операции фоторефракционной кератэктомии, выполняемой в клинике. Второй метод нацелен только на иннервацию, разделяя ее по периферии с помощью биопсийного пуансона, сохраняя целостность эпителия. Этот метод аналогичен первым этапам поклеточной кератопластики и приводит к дегенерации иннервации с последующим отрастанием аксонов в центральной части роговицы. Последний метод повреждает иннервацию трансгенной мышиной модели с помощью многофотонного микроскопа, который специфически локализует место прижигания флуоресцентных нервных волокон. Этот метод наносит тот же вред, что и фотокератит, чрезмерное воздействие ультрафиолета.
В данном исследовании описаны различные варианты изучения физиопатологии иннервации роговицы, в частности, дегенерации и регенерации аксонов. Стимуляция регенерации имеет решающее значение для предотвращения таких осложнений, как дефекты эпителия или даже перфорация роговицы. Предложенные модели могут помочь в тестировании новых фармакологических молекул или генной терапии, которые усиливают регенерацию нервов и ограничивают прогрессирование заболевания.
Роговица, которая представляет собой прозрачную поверхность глаза, состоит из трех отдельных слоев: эпителия, стромы и эндотелия. Этот орган имеет самую высокую плотность иннервации в организме и состоит в основном из сенсорных волокон (типов Аδ и С), берущих начало от глазной ветви тройничного ганглия. Сенсорные волокна проникают на периферию роговицы в середине стромы в виде больших пучков, которые разветвляются, покрывая поверхность. Затем они раздваиваются, чтобы пронзить мембрану Боумана и сформировать суббазальное сплетение, которое легко распознать по образованию вихря в центре роговицы. Эти волокна оканчиваются свободными нервными окончаниями на наружной поверхности эпителия. Они способны преобразовывать тепловые, механические и химические раздражители и высвобождать трофические факторы, необходимые для гомеостаза эпителия 1,2. Нейротрофический кератит (НК) – это дегенеративное заболевание, поражающее сенсорную иннервацию роговицы. Это редкое заболевание возникает из-за снижения или потери чувствительности роговицы, что приводит к снижению слезообразования и плохим заживляющим свойствам роговицы3. НК прогрессирует через три хорошо описанные стадии: от стадии 1, когда пациенты страдают от дефектов эпителия, до стадии 3, когда происходит расплавление стромы и/или перфорация роговицы4.
Клинически происхождение этого заболевания может быть разнообразным. Пациенты могут потерять иннервацию роговицы после физической травмы глаза, хирургического вмешательства или из-за хронических заболеваний, таких как диабет 5,6. На сегодняшний день процесс патогенеза НК остается малоизученным, а терапевтические возможности для этого угрожающего зрению состояния очень ограничены. Таким образом, необходимо лучшее понимание характеристик дефектов эпителия, чтобы лучше понять механизмы, лежащие в основе регенерации этих волокон и потенциально способствовать их развитию. В данной работе мы предлагаем несколько моделей повреждения роговицы, которые индуцируют НК у мышей.
Первая модель – истирание эпителиального слоя роговицы глазным бором. Эта модель в основном изучалась в контексте регенерации эпителия у различных животных, таких как грызуны и рыбы 7,8,9, а также для тестирования молекул, способствующих заживлению роговицы10,11. Физиологически эпителиальным клеткам требуется 2-3 дня, чтобы закрыть рану. Физиологическая картина иннервации, однако, требует более четырех недель, чтобы восстановиться после истирания12,13. Во время операции глазной бор удаляет эпителиальный слой роговицы, который содержит суббазальное сплетение и свободные нервные окончания волокон. Эту процедуру клинически можно сравнить с процедурой пациентов с фоторефракционной кератэктомией (ФРК) для коррекции дефектов рефракции глаза. Процедура заключается в удалении эпителия роговицы с последующим изменением формы стромы с помощью лазера14. Пациенты могут испытывать несколько побочных эффектов после такой операции, таких как снижение плотности роговичных нервов в течение 2 лет и снижение чувствительности в течение периода от 3 месяцев до одного годапосле операции. Учитывая, что операция вызывает хрупкость микроокружения роговицы, эта модель может помочь исследовать эти побочные эффекты и разработать терапевтические подходы, которые будут способствовать более быстрой реиннервации, тем самым уменьшая рассматриваемые побочные эффекты.
Вторая модель состоит в секционировании аксонов на периферии роговицы с помощью биопсийного пуансона, индуцируя валлерову дегенерацию центральной иннервации 16. Клинически этот метод можно сравнить с передней послойной кератопластикой, при которой хирург осуществляет частичную трепанацию роговицы для удаления части передней толщины роговицы и замены ее донорским трансплантатом 17. После послойной кератопластики пациенты могут страдать от ряда симптомов, включая сухость глаз, потерю иннервации роговицы и отторжение трансплантата18. Эта модель аксотомии, выполненная на нервах роговицы, может дать представление о механизмах дегенерации волокон, которая происходит после трансплантата с последующей регенерацией аксонов.
Третий метод повреждает нервы роговицы лазером. При использовании многофотонного микроскопа на роговице животных, находящихся под наркозом, индуцируется дегенерация нервов, локализованных в оптическом поле, в результате образования активных форм кислорода (АФК), что приводит к повреждению ДНК и клеточной кавитации19. Этот метод повторяет фотоповреждение роговицы, вызванное чрезмерным воздействием естественного ультрафиолета (солнечный ожог), которое также вызывает образование АФК, что приводит к повреждению ДНК20. Пациенты, страдающие солнечными ожогами роговицы, испытывают сильную боль, так как разрушение эпителиальных клеток лишает конечности роговичных волокон.
Три метода, описанные здесь, предназначены для исследования процесса патогенеза НК и регенерации аксонов. Они легко воспроизводимы и точны. Кроме того, они позволяют быстро восстанавливаться и легко следить за животными.
Нейротрофический кератит считается редким заболеванием, поражающим 5 из 10 000 человек. Однако люди, страдающие от НК из-за физических травм, таких как химические ожоги, или синдромов, таких как диабет или рассеянный склероз, не включены вэти статистические данные. Кроме того, …
The authors have nothing to disclose.
Авторы благодарят доктора Карин Лулье за доступ к трансгенной мышиной линии MAGIC-Markers. Авторы также выражают признательность центру RAM-Neuro и центру визуализации MRI, входящему в национальную инфраструктуру France-BioImaging при поддержке Французского национального исследовательского агентства (ANR-10-INBS-04, «Инвестиции в будущее»). Это исследование было поддержано программой ATIP-Avenir, Inserm, Région Occitanie, Университетом Монпелье, Французским национальным исследовательским агентством (ANR-21-CE17-0061), Фондом регенеративной медицины (FRM Regenerative Medicine, REP202110014140) и Фондом Groupama.
0.2 µm seringe filter | CLEARLINE | 51733 | |
0.5 mm rust ring remover | Alger Equipment Company | BU-5S | |
2 mL plastic tubes | Eppendrof | 30120094 | |
Algerbrush burr, Complete instrument | Alger Equipment Company | BR2-5 | |
Anti-beta III Tubulin antibody | Abcam | ab18207 | |
Antigenfix | Diapath | P0016 | |
Artificial tear | Larmes artificielles Martinet | N/A | |
Buprecare | Animalcare | N/A | |
Cotton swab | Any provider | N/A | |
Dissecting tools | Fine Science Tools | N/A | |
Fluorescein | Merck | 103887 | |
Gelatin from cold water fish skin | Sigma | G7765 | |
Goat serum | Merck | S26 | |
Head Holder | Narishige | SGM 4 | |
Heated plate | BIOSEB LAB instruments | BIO-HE002 | |
Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
Imalgene 1000 | BOEHRINGER INGELHEIM ANIMAL HEALTH France | N/A | French marketing authorization numbre: FR/V/0167433 4/1992 |
LAS X software | Leica | N/A | Large volume computational clearing (LVCC) process |
Laser Chameleon Ultra II | Coherent | N/A | |
Laser power meter | Coherent | N/A | |
Leica Thunder Imager Tissue microscope | Leica | N/A | |
Multi-photon Zeiss LSM 7MP upright microscope | Zeiss | N/A | |
Ocry-gel | TVM lab | N/A | |
Parametric oscillator | Coherent | N/A | |
Penlights with blue cobalt filtercap | Bernell | ALPEN | |
Petri dish | Thermo Scientific | 150318 | Axotomy protocol |
Petridish | Thermo Scientific | 150288 | Cornea whole-mount processing |
Rompun 2% | Elanco | N/A | French marketing authorization numbre: FR/V/8146715 2/1980 |
Sterile biopsy punch 2.5 mm | LCH medical | LCH-PUK-25 | |
Triton X-100 | VWR | 0694 | |
Vectashield | EuroBioSciences | H-1000 | Mounting medium |