Özet

העשרה מהירה ויעילה של תאי מיקרוגליה בחוט השדרה של עכבר

Published: September 22, 2023
doi:

Özet

מיקרוגליה נחשבים לחלק מהתאים הרבגוניים ביותר בגוף, המסוגלים להסתגלות מורפולוגית ותפקודית. ההטרוגניות והרב-תכליתיות שלהם מאפשרות שמירה על הומאוסטזיס מוחי, תוך שהם קשורים גם לפתולוגיות נוירולוגיות שונות. כאן מתוארת טכניקה לטיהור מיקרוגליה של חוט השדרה.

Abstract

עמוד השדרה מגדיר חוליה ומעצב את תעלת עמוד השדרה, חלל התוחם ושומר על חוט השדרה. התפתחות ותפקוד תקין של מערכת העצבים המרכזית של יונקים מסתמכים באופן משמעותי על פעילותם של מקרופאגים מקומיים המכונים מיקרוגליה. מיקרוגליה מציגה הטרוגניות ורב-תפקודיות, ומאפשרת ביטוי גנים והתנהגות מובחנים בתוך חוט השדרה והמוח. מחקרים רבים בחנו את תפקוד תאי המיקרוגליה במוח, ומפרטים בהרחבה את שיטות הטיהור. עם זאת, טיהור תאי מיקרוגליה מחוט השדרה בעכברים חסר תיאור מקיף. לעומת זאת, השימוש בקולגנאז מטוהר מאוד, בניגוד לתמצית לא מזוקקת, חסר דיווח ברקמות מערכת העצבים המרכזית. במחקר זה, עמוד השדרה וחוט השדרה נכרתו מעכברי C57BL/6 בני 8-10 שבועות. העיכול שלאחר מכן השתמש בקולגנאז מטוהר מאוד, וטיהור מיקרוגליה השתמש בשיפוע צפיפות. התאים עברו צביעה לצורך ציטומטריית זרימה, הערכת כדאיות וטוהר באמצעות צביעת CD11b ו-CD45. התוצאות הניבו כדאיות ממוצעת של 80% וטוהר ממוצע של 95%. לסיכום, מניפולציה של מיקרוגליה בעכבר כללה עיכול עם קולגן מטוהר מאוד, ואחריו שיפוע צפיפות. גישה זו יצרה למעשה אוכלוסיות משמעותיות של מיקרוגליה בחוט השדרה.

Introduction

המאפיין המגדיר של בעלי חוליות הוא עמוד השדרה או עמוד השדרה, שבו הנוטוכורד הוחלף ברצף של עצמות מקוטעות הנקראות חוליות, המחולקות על ידי דיסקים בין-חולייתיים. רצף זה של חומר גלוסקמי מעצב את תעלת עמוד השדרה, חלל התוחם ומגן על חוט השדרה1. בסוג Rodentia, עמוד השדרה נוצר בדרך כלל על ידי שבע חוליות צוואריות, שלוש עשרה חוליות בית החזה, שש חוליות מותניות ומספר משתנה של חוליות קאודליות 2,3. אורך חוט השדרה דומה לזה של עמוד השדרה, והפילום הטרמינלי הוא מבנה לא עצבי המעגן את חוט השדרה לעצה. בנוסף, סיבי עצב יוצאים דרך הפתח הבין חולייתי1.

התפתחותה ותפקודה התקין של מערכת העצבים המרכזית ביונקים תלויים באופן קריטי בפעילות המקרופאגים השוכנים במערכת העצבים, הנקראים מיקרוגליה4. למרות שתאי מיקרוגליה תוארו בתחילה כפגוציטים שוכני מוח, מחקר שנערך לאחרונה ייחס תפקודים דינמיים רבים לתאים אלה 5,6. גודלה של מיקרוגליה נע בין 7 ל -10 מיקרומטר בהומאוסטזיס; הם נחשבים בין התאים הרבגוניים ביותר בגוף ויכולים להסתגל מורפולוגית ותפקודית לסביבתם המשתנה ללא הרף7. תאים אלה מפגינים הטרוגניות גבוהה הן בשלב העוברי והן בשלב הבוגר 8,9, ואילו בשלב הבוגר הם מפגינים גם הטרוגניות תפקודית מורכבת בהתבסס על ההקשר המרחבי-זמני שלהם10. ההטרוגניות והתפקודים המרובים של תאי מיקרוגליה מאפשרים ביטוי גנים דיפרנציאליים והתנהגות בחוט השדרה ובמוח. הוכח כי ביטוי CD11b, CD45, CD86 ו- CCR9 גבוה יותר בחוט השדרה בהשוואה למוח 8,9.

קיימים פרוטוקולים מרובים לבידוד תאי מיקרוגליה במוח11,12; עם זאת, רק מעטים קיימים עבור מיקרוגליה חוט השדרה13,14. אופטימיזציה של שיטה לטיהור מיקרוגליה מחוט השדרה מאפשרת פיתוח של מחקרים מרובים המתמקדים בגילוי הפיזיולוגיה של מיקרוגליה. פרוטוקול זה נועד לתאר מיצוי פשוט וקל מאוד לשחזור של חוט השדרה של העכבר וטיהור תאי מיקרוגליה (איור 1).

Protocol

המחקר נערך בהתאם לתקן המקסיקני הרשמי NOM-062-ZOO-1999 והמדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. האישור למחקר התקבל מוועדות המחקר, האתיקה והבטיחות הביולוגית של בית החולים לילדים במקסיקו (HIM/2023/006) ומועדת המחקר והביואתיקה של בית החולים הכללי של מקסיקו אדוארדו ליסאגה (DI/21/501/04/62). שלושה עכברי C57BL/6 בגילאי 6 עד 8 …

Representative Results

עיכול אנזימטי באמצעות רקמת חוט השדרה של עכבר בוצע באמצעות תערובת מועשרת מאוד בקולגנאז ותרמוליזין. הרקמה המעוכלת שנוצרה עברה מעבר דרך מסנן של 40 מיקרומטר כדי לחסל חומר לא מעוכל. התאים שנאספו הועשרו באמצעות שיפוע צפיפות פרקול, עם 90% בחלק התחתון ו-45% בחלק העליון. התאים המועשרים במיקרוגליה בתוך…

Discussion

פרוטוקולים רבים פותחו לחקר תאי מיקרוגליה בשל חשיבותם בהומאוסטזיס של המוח. בשיטות אלה, תאי מיקרוגליה מקורם בדרך כלל בהמיספרות מוחיות של חולדות ועכברים עובריים או יילודים17. מספר מצומצם של מחקרים התייחסו לטיהור תאי מיקרוגליה מחוט השדרה של עכברים בוגרים13,14<sup …

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמלגה שהוענקה על ידי המועצה הלאומית למדע וטכנולוגיה (CONACYT) (702361). המחברים מודים לתוכנית הדוקטורט במדעי הכימיה הביולוגית של בית הספר הלאומי למדעים ביולוגיים של המכון הפוליטכני הלאומי.

Materials

15 mL collection tubes Corning, USA 430790
2 mL microtubes Axygen, USA MCT-200-G
2.4G2 anti-FcR BioLegend, USA 101302
50 mL collection tubes Corning, USA 430829
70% ethanol
Antibiotic-Antimycotic (penicillin, streptomycin, amphotericin b) Gibco, USA 15240062
Antibody CD11b eFluor 450 anti-mouse eBioscience, USA 48-0112
Antibody CD45 PerCP anti-mouse   BioLegend, USA 103130
Balanced salt solution (PBS) calcium- magnesium-free Corning, USA 46-013-CM
Blue Cell Strainer 40 μm Corning, USA 352340
Costar 6-well Clear Not Treated  Corning, USA CLS3736
Coverslips
Digital Heating Shaking Drybath  Thermo Scientific Digital HS Drybath, USA 88870001
Dissecting forceps for microsurgery FT by DUMONT
DNase Roche, USA 4536282001
Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium-high glucose (DMEM)  Merck, USA D6429
Electric shaver
FACS tube Thermo, USA 352058
Fetal bovine serum (FBS) PAN Biotech, Alemania P30-3306
Flow cytometer Cytoflex  Beckman Coulter
Hank’s balanced salt solution  Merck, USA H2387
L-glutamine Corning, USA  15393631
Liberase TM  Roche, USA 5401119001
Neubauer chamber Counting Chambers China 1103
Pentobarbital
Percoll  Merck, USA 17089101 density gradient centrifugation 
Poly-L-lysine solution  Merck, USA P8920
Scalpel No. 25  HERGOM, Mexico H23
Snaplock Microcentrifuge Tubes 2 mL Axygen, USA 10011-680
Stereoscopic microscope Velab, Mexico HG927831
Straight surgical scissors (10 cm) HERGOM, Mexico
Straight Vannas scissors HERGOM, Mexico
Triton X100 Merck, USA X100
Trypan blue Stain 0.4%  Merck, USA 15250-061
Vortex mixer DLAB, China 8031102000
Zombie Aqua Fixable Viability Kit BioLegend, USA 423102 amine-reactive fluorescent dye staining 

Referanslar

  1. Schröder, H., Schröder, , Moser, , Huggenberger, , et al. . Neuroanatomy of the Mouse. , 59-78 (2020).
  2. Sengul, G., et al. Cytoarchitecture of the spinal cord of the postnatal (P4) mouse. Anat Rec. 295, 837-845 (2012).
  3. Bab, I., et al. . Microtomographic atlas of the mouse skeleton. VIII, 205 (2007).
  4. Nayak, D., et al. Microglia development and function. Annu Rev Immunol. 32, 367-402 (2014).
  5. Martinez, F. O., et al. Macrophage activation and polarization. Front Biosci. 13, 453-461 (2008).
  6. Masuda, T., et al. Microglia heterogeneity in the single-cell era. Cell Rep. 30 (5), 1271-1281 (2020).
  7. Prinz, M. Microglia biology: one century of evolving concepts. Cell. 179 (2), 292-311 (2019).
  8. de Haas, A. H., et al. Region-specific expression of immunoregulatory proteins on microglia in the healthy CNS. Glia. 56 (8), 888-894 (2008).
  9. Xuan, F. L., et al. Differences of microglia in the brain and the spinal cord. Front Cell Neurosci. 13, 504 (2019).
  10. Paolicelli, R. Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads. Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).
  11. Li, Q., et al. Spinal IL-36γ/IL-36R participates in the maintenance of chronic inflammatory pain through astroglial JNK pathway. Glia. 67 (3), 438-451 (2019).
  12. Prinz, M., et al. Microglia and central nervous system-associated macrophages-from origin to disease modulation. Annu Rev Immunol. 39, 251-277 (2021).
  13. Yip, P. K., et al. Rapid isolation and culture of primary microglia from adult mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 183 (2), 223-237 (2009).
  14. Akhmetzyanova, E. R., et al. Severity- and time-dependent activation of microglia in spinal cord injury. Int J Mo. Sci. 24 (9), 1-16 (2023).
  15. Mahadevan, V. Anatomy of the vertebral column. Surgery. 36 (7), 327-332 (2018).
  16. Krukowski, K., et al. Temporary microglia-depletion after cosmic radiation modifies phagocytic activity and prevents cognitive deficits. Sci Rep. 8 (1), 1-13 (2018).
  17. Cardona, A., et al. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
  18. Schmidt, V. M., et al. Comparison of the enzymatic efficiency of Liberase TM and tumor dissociation enzyme: effect on the viability of cells digested from fresh and cryopreserved human ovarian cortex. Reprod Biol Endocrinol. 16 (57), 1-14 (2018).
  19. Kusminski, C. M., et al. MitoNEET-parkin effects in pancreatic α- and β-cells, cellular survival, and intrainsular cross talk. Diabetes. 65 (6), 1534-1555 (2016).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Gutiérrez-Román, C. I., Meléndez Camargo, M. E., García Rojas, C. C., Jimenez Olvera, M., Gutiérrez Román, S. H., Medina-Contreras, O. Rapid and Efficient Enrichment of Mouse Spinal Cord Microglia. J. Vis. Exp. (199), e65961, doi:10.3791/65961 (2023).

View Video