זיהוי וכימות של מונו-רמנוליפידים ודי-רמנוליפידים המיוצרים על ידי Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa הוא חיידק סביבתי ופתוגן אופורטוניסטי בעל דאגה רבה בשל ייצורו של תכונות הקשורות לאלימות ועמידותו הגבוהה לאנטיביוטיקה ^1,2. מטבוליט משני אופייני המיוצר על ידי חיידק זה הוא RL biosurfactant, אשר מיוצר באופן מתואם עם מספר תכונות הקשורות לאלימות כגון פנזין pyocyanin, אנטיביוטיקה עם פעילות חמצון-חיזור, ואת פרוטאז elastase³. תכונות הטנסיו-אקטיביות והתחליב של RL נוצלו ביישומים תעשייתיים שונים וכיום הן ממוסחרות⁴.

רוב זני P. aeruginosa, השייכים לקבוצות פילוגרופ 1 ו-2, מייצרים שני סוגים של RL: mRL, המורכב ממויטי רמנוז אחד המקושר לדימר חומצת שומן המורכב בעיקר מ-10 פחמנים, ו-dRL, המכיל רמנוז מואטי נוסף הקשור לרמנוז⁴ הראשון (ראו איור 1). עם זאת, דווח כי שתי קבוצות פילוגרופ מינוריות של P. aeruginosa (קבוצות 3 ו -5) מייצרות רק mRL ^5,6. שני סוגי RL מכילים תערובת של דימרים של חומצות שומן, שכאמור הם בעיקר C10-C10, אך מיוצרים גם פרופורציות קטנות יותר של מולקולות המכילות דימרים C12-C10, C12-C12 ו-C10-C12:1. אפיון קונגנרי RL המיוצרים על ידי זנים שונים באמצעות HPLC MS/MS דווח ^7,8. השיטות המתוארות בעבודה זו יכולות רק להבדיל בין mRL ו- dRL אך אינן יכולות לשמש לאפיון של קונגנרים RL.

P. aeruginosa וכמה מיני Burkholderia הם יצרנים טבעיים של RL⁹, אבל החיידק לשעבר הוא היצרן היעיל ביותר. עם זאת, RL בשימוש מסחרי מיוצר כיום בנגזרות Pseudomonas putida KT2440 המבטאות גנים P. aeruginosa כדי למנוע את השימוש בפתוגן אופורטוניסטי^{זה 10,11}. לגילוי וכימות של RL המיוצר על ידי P. aeruginosa חשיבות רבה לחקר המנגנונים המולקולריים המעורבים בביטוי תכונות הקשורות לאלימות¹², באפיון זנים השייכים לקלאדים 3 או 5¹³, ובבניית נגזרות P. aeruginosa המייצרות יתר על המידה ביו-פעילי שטח אלה תוך הפחתת האלימות¹⁴. הייצור של biosurfactants על ידי מיקרואורגניזמים שונים זוהה מבוסס על כמה מאפיינים כלליים של תרכובות אלה, כגון שיטת נפילת קריסה או מדד תחליב¹⁵, אבל שיטות אלה אינן מדויקות או ספציפיות¹⁶.

במאמר זה אנו מתארים את הפרוטוקול לזיהוי mRL ו-dRL באמצעות מיצוי נוזלי של סך כל ה-RL מתרבית העל-נאטנטים של זנים שונים מסוג P. aeruginosa, וההפרדה של שני סוגי RL באמצעות TLC. בשיטה זו, ה-RL המופק מהתרבית מופרד על ידי המסיסות הדיפרנציאלית שלהם בממסים המשמשים ל-TLC, מה שגורם לנדידה דיפרנציאלית על צלחת ג’ל הסיליקה. לכן, mRL יש הגירה מהירה יותר מאשר dRL, והם יכולים להיות מזוהים כתמים נפרדים כאשר לוחות מיובשים ומוכתמים עם α-naphthol.

השיטה המתוארת כאן לאיתור mRL ו- dRL על ידי TLC מבוססת על מאמר¹⁷ שפורסם בעבר, שהוא קל לביצוע ואינו דורש ציוד יקר. שיטה זו הייתה שימושית לאיתור RL במבודדי P. aeruginosa ^{שונים 13} באמצעות בקרות מתאימות, כגון מוטציה שמקורה ב-P. aeruginosa שאינה מסוגלת לייצר RL. עם זאת, זו אינה השיטה המועדפת לאפיון ביו-פעילי שטח חדשים המיוצרים על ידי חיידקים שאינם Pseudomonas aeruginosa בשל חוסר הספציפיות שלה.

בנוסף, מוצגת שיטה לכימות המקבילות של RL הכולל המופק מסופרנאטנט תרבית P. aeruginosa . שיטה זו מכמתת ביו-פעילי שטח אלה בהתבסס על התגובה של אורצינול עם סוכרים רדוקטיביים, וכתוצאה מכך נוצר מוצר שניתן למדוד ספקטרופוטומטרית ב-421 ננומטר, כפי שתואר קודם לכן¹⁸. מכיוון שהתגובה עם אורצינול אינה ספציפית לרמנוז, חשוב לבצע שיטה זו עם RL המופק מתרבית העל שאינה מכילה כמויות משמעותיות של מולקולות אחרות המכילות סוכר, כגון ליפופוליסכרידים (LPS). תערובת כלורופורם/מתנול חומצית משמשת כאן למיצוי נוזלי של RL¹⁸, אך ניתן להשתמש גם באתיל אצטט, ומיצוי בשלב מוצק (SPE) מניב תוצאות טובות מאוד¹⁹. שיטת האורצינול המתוארת כאן אינה דורשת ציוד מתוחכם ויכולה לספק תוצאות אמינות אם מבוצעת בזהירות מיוחדת בהכנת הדגימות המנותחות, כפי שנדון. כדי להבטיח הכנת דגימה נאותה, חשוב לכלול מוטנט Pseudomonas aeruginosa rhlA שאינו מסוגל לייצר RL²⁰ ולבצע שלושה שכפולים ביולוגיים ושלושה טכניים לכל קביעה.

הייתה מחלוקת משמעותית בספרות^16,21 לגבי קביעת RL בשיטת אורצינול, כאשר כמה מחקרים מציעים כי ייצור RL מוערך יתר על המידה וכי הבדיקה חסרה ספציפיות עבור rhamnose, פוטנציאל גילוי סוכרים אחרים. עם זאת, אנו מראים כאן כי השיטות המתוארות יכולות להיות מדויקות וספציפיות בתנאים המתאימים. יתר על כן, לצורך השוואה עם ההליכים המתוארים במאמר זה, אנו משתמשים בזיהוי UPLC-MS/MS של תקן dRL ומדגימים כי תוצאות דומות מתקבלות בשיטת אורצינול. הפרוטוקול המפורט לכימות RL בשיטה זו כלול בקובץ משלים 1.

פרוטוקולים אלה מודגמים באמצעות זני הסוג PAO1 (פילוגרופ 1), PA14 (פילוגרופ 2) ו-PA7 (פילוגרופ 3). זנים אלה נבחרו מכיוון שהם מאופיינים היטב ומייצרים פרופילי RL שונים.