Aqui apresentamos um protocolo para estudar a taxa de iniciação de morte celular programada por imagens contínuas de folhas inoculadas após indução de morte celular.
A resistência conferida pela resposta hipersensível (HR) é uma resposta de defesa efetiva que pode ser determinada pelos genes de resistência ao N . A HR manifesta-se como a formação de zonas de morte celular nas folhas inoculadas. Aqui, um protocolo para estudar a taxa de iniciação da morte celular por imagem de folhas inoculadas no tempo entre o início da morte celular e o aparecimento da morte celular usando um microscópio digital é apresentado. O microscópio digital permite um processo contínuo de aquisição de imagens em intervalos desejados, o que permite uma determinação precisa da taxa de iniciação de morte celular em até minutos exatamente, ao contrário de horas nos métodos tradicionais. A imagem com o microscópio digital também é independente da luz e, portanto, pode ser usada durante o dia e a noite sem perturbar o ritmo circadiano da planta. Diferentes patossistemas que resultam no desenvolvimento de morte celular programada podem ser estudados usando este protocolo com pequenas modificações. De modo geral, o protocolo permite, portanto, a identificação simples, precisa e barata da taxa de iniciação de morte celular.
A batata é uma das culturas alimentares mais cultivadas do mundo, em quarto lugar, atrás do arroz, trigo e milho. No entanto, a produção de batata pode ser severamente afetada pelo vírus Y da batata (PVY), que atualmente é considerado seu patógeno viral mais importante 1,2. Em plantas de batata cv. Rywal, várias cepas de PVY (incluindo a cepa PVY N-Wilga) desencadeiam resistência conferida por resposta de hipersensibilidade (HR), onde a restrição do patógeno ao local da infecção se manifesta como lesões necróticas nas folhas inoculadas3. Nesse patossistema, a HR é mediada pelo gene de resistência Ny-1, que é dependente da temperatura, uma vez que plantas cultivadas em temperaturas mais baixas desenvolvem eficientemente lesões necróticas, enquanto em plantas cultivadas constitutivamente em temperatura elevada (28 °C), o aborto de resistência é demonstrado como ausência de formação de lesões e disseminação sistêmica do vírus 3,4. Quando as plantas são transferidas para uma temperatura mais baixa (22 °C), inicia-se a morte celular, que pode ser explorada para acompanhar a taxa de início da morte celular por imagem das folhas inoculadas no tempo entre o início da morte celular e o aparecimento da morte celular.
Este protocolo demonstra um método simples para a determinação da taxa de iniciação de morte celular usando um microscópio digital. Através da obtenção de imagens das folhas inoculadas após a transferência da planta de 28 °C para 22 °C, um microscópio digital permite a observação contínua da folha em intervalos desejados. Diferentemente do uso de outros métodos (por exemplo, microscopia confocal ou observação da formação da lesão a olho nu), este permite determinar o tempo exato de formação da lesão e, portanto, a taxa de iniciação da morte celular até minutos exatamente, ao contrário das horasnos métodos citados 5,6. O uso do microscópio digital também é independente da luz e, portanto, pode ser usado durante o dia e a noite. Este protocolo também pode ser usado para identificar componentes envolvidos no início da morte celular ou para determinar os efeitos de diferentes componentes na taxa de iniciação da morte celular se as plantas usadas forem transgênicas e tiverem níveis alterados de componentes de interesse.
O protocolo demonstrado permite que o usuário determine com precisão a taxa de iniciação da morte celular por meio de imagens contínuas de folhas inoculadas no tempo entre o início da morte celular e o aparecimento da morte celular usando um microscópio digital. Embora existam inúmeras formas de monitorar a ocorrência de lesões e doenças de plantas12,13,14,15, esse protocolo apresenta a vantagem de medir sem perturbar o ritmo circadiano da planta, uma vez que a luz é apagada entre as medidas.
Após a inoculação, as plantas devem crescer a 28 °C por 3 dias. O gene de resistência Ny-1 , que induz uma resposta de hipersensibilidade, é dependente da temperatura e, em plantas cultivadas em temperaturas mais elevadas, leva ao aborto da resistência, que se manifesta como falta de formação de lesões e disseminação sistêmica do vírus3. Depois que as plantas são transferidas para 22 °C, a morte celular é iniciada, portanto, para resultados precisos, a observação com um microscópio digital deve começar o mais rápido possível após essa transferência. Outro passo crucial no preparo da planta para a obtenção de imagens é a imobilização da folha (Figura 1D), pois a planta continuará a crescer durante a obtenção de imagens, o que pode tirar a folha observada do foco, ou tal configuração não dará os resultados desejados.
Se o protocolo descrito for usado em plantas transgênicas com componentes de interesse alterados, hipotetizados para estarem envolvidos no início da morte celular, o protocolo permite ao usuário determinar se o nível diminuído de um componente estudado afeta a taxa de iniciação da morte celular. Com isso, componentes envolvidos no início da morte celular podem ser identificados em patossistemas, onde ocorre morte celular programada, utilizando este protocolo. Outros métodos para identificar esses componentes são, por exemplo, a análise transcriptômica como RNA-seq ou várias formas de microscopia, que podem ser caras edemoradas16. O método descrito neste protocolo permite a identificação fácil e barata dos componentes envolvidos no início da morte celular, observando diferenças nas taxas de iniciação de morte celular entre plantas transgênicas e controle. Idealmente, em tal configuração, duas câmeras digitais devem ser usadas, pois uma planta transgênica deve ser analisada em paralelo com uma planta controle dentro do mesmo experimento.
Nesse protocolo, utilizou-se a cepa PVY N-Wilga; no entanto, outras cepas desse vírus, por exemplo, PVY marcado com GFP (PVY-N605(123)-GFP)7, também poderiam ser usadas. Além disso, outros patossistemas, que resultam no desenvolvimento de morte celular programada, poderiam ser estudados usando este protocolo com pequenas modificações.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Barbara Jaklič pela assistência técnica. Esta investigação foi financiada pela Agência Eslovena de Investigação e Inovação (financiamento do núcleo de investigação n.º P4-0165 e projeto Z4-3217: Decifrando a interligação da sinalização relacionada com redox na resistência da batata contra vírus).
Alcohol burner | Mikro+Polo | SH-234002455 | For tweezers and scalpel sterilization |
Autoclave A-21 CAV | Kambi | N/A | |
Bacto Agar | Becton, Dickinson and Company | 214010 | |
Carborundum powder | VWR Chemicals | 22505297 | |
DinoCapture 2.0 | Dino-Lite | Version 2.0 | software for digital microscope |
Dino-Lite Edge AM7915MZTL digital microscope | AnMo Electronics Corporation | AM7915MZTL | |
Ethanol, 70% | Stella Tech | P94000 | For tweezers and scalpel sterilization |
Extraction bags | Bioreba | 420100 | |
Growth chamber FS-WI | Photon Systems Insturments | N/A | |
Hand homogenizer | Bioreba | 400010 | |
Hawita Special Substrate | HAWITA Gruppe | 2000000071701 | Ready to use substrate, made using peat (H4-H6 and H6-H8) |
Hydrochloric acid (HCl) | Merck | 109057 | |
Label tape | Sigma | L8144-5EA | |
Laptop computer with installed DinoCapture 2.0 | HP | Z2V77EA#BED | Computer needs to be transferable as experiment takes part in a growth chamber |
Murashige and Skoog medium | Duchefa Biochemie | M02220100 | |
Na2HPO4 | Emsure | 1065860500 | |
NaH2PO4 | Emsure | 1064700250 | |
Pasteur pipette 0.5 mL | Brand | 21500209 | |
pH-meter | Mettler Toledo | ML1601 | |
Plastic boxes | Cvetlice Dornig | VCG10.5 | Radius = 10.5 cm |
Plastic pots | Lab Associates | DIS40003 | Radius = 11.5 cm (top), Radius = 9.8 cm (bottom) |
Saccharose | Kemika d.d. | 1800408 | |
Sodium Diethyldithiocarbamate (DIECA) | Sigma-Aldeich | 228680 | Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate, ACS reagent |
Sodium hydroxide (NaOH) | Merck | 106462 | |
Sterile surgical blades | Braun | 4511733633 | |
Tweezers | Braun | BD033R |