כאן אנו מציגים פרוטוקול לחקר קצב התחלת מוות תאי מתוכנת על ידי הדמיה רציפה של עלים מחוסנים לאחר השראת מוות תאי.
תגובת רגישות יתר (HR) היא תגובת הגנה יעילה שניתן לקבוע על ידי הגנים של עמידות N . HR מתבטא בהיווצרות אזורי מוות של תאים על עלים מחוסנים. כאן מוצג פרוטוקול לחקר קצב התחלת המוות התאי על ידי הדמיית עלים מחוסנים בזמן שבין התחלת המוות התאי לבין הופעת המוות התאי באמצעות מיקרוסקופ דיגיטלי. המיקרוסקופ הדיגיטלי מאפשר תהליך הדמיה רציף בפרקי זמן רצויים, המאפשר קביעה מדויקת של קצב התחלת מוות תאי עד דקות בדיוק, בניגוד לשעות בשיטות מסורתיות. גם הדמיה במיקרוסקופ דיגיטלי אינה תלויה באור ולכן ניתן להשתמש בה ביום ובלילה מבלי להפריע לשעון הביולוגי של הצמח. ניתן לחקור פתו-מערכות שונות הגורמות להתפתחות מוות תאי מתוכנת באמצעות פרוטוקול זה עם שינויים קלים. בסך הכל, הפרוטוקול מאפשר זיהוי פשוט, מדויק וזול של שיעור התחלת מוות תאי.
תפוח אדמה הוא אחד מגידולי המזון הנפוצים ביותר בעולם, מקום רביעי אחרי אורז, חיטה ותירס. עם זאת, ייצור תפוחי אדמה יכול להיות מושפע קשות על ידי וירוס תפוחי אדמה Y (PVY), אשר נחשב כיום פתוגן הנגיף החשוב ביותר שלה 1,2. בצמחי תפוחי אדמה cv. Rywal, מספר זנים של PVY (כולל זן PVY N-Wilga) מעוררים תגובה רגישה (HR) – התנגדות המוענקת, כאשר הגבלת הפתוגן לאתר הזיהום מתבטאת בנגעים נמקיים על עלים מחוסנים3. בפתומערכת זו, HR מתווך על ידי גן עמידות Ny-1, שהוא תלוי טמפרטורה, שכן צמחים הגדלים בטמפרטורות נמוכות יותר מפתחים ביעילות נגעים נמקיים, ואילו בצמחים הגדלים באופן קונסטיטוטיבי בטמפרטורה גבוהה (28 מעלות צלזיוס), הפלה של עמידות מודגמת כחוסר היווצרות נגעים והתפשטות וירוס מערכתית 3,4. כאשר הצמחים מועברים לטמפרטורה נמוכה יותר (22 מעלות צלזיוס), מתחיל מוות תאי, אשר יכול להיות מנוצל כדי לעקוב אחר קצב התחלת המוות התא על ידי הדמיה של עלים מחוסנים בזמן שבין התחלת המוות התא לבין הופעת המוות התאי.
פרוטוקול זה מדגים שיטה פשוטה לקביעת קצב התחלת מוות תאי באמצעות מיקרוסקופ דיגיטלי. על ידי הדמיה של העלים המחוסנים לאחר העברת הצמח מ-28 מעלות צלזיוס ל-22 מעלות צלזיוס, מיקרוסקופ דיגיטלי מאפשר תצפית רציפה על העלה בפרקי זמן רצויים. בניגוד לשימוש בשיטות אחרות (למשל, מיקרוסקופ קונפוקלי או תצפית על היווצרות נגעים בעין בלתי), הדבר מאפשר לקבוע את הזמן המדויק של היווצרות הנגע ולכן קצב התחלת המוות התאי עד דקות בדיוק, בניגוד לשעות בשיטות הנ”ל 5,6. גם השימוש במיקרוסקופ דיגיטלי אינו תלוי באור ולכן ניתן להשתמש בו ביום ובלילה. פרוטוקול זה יכול לשמש גם לזיהוי רכיבים המעורבים בהתחלת מוות תאי או כדי לקבוע את ההשפעות של רכיבים שונים על קצב התחלת מוות תאי אם צמחים משומשים הם טרנסגניים ויש להם רמות שונות של רכיבים מעניינים.
הפרוטוקול שהודגם מאפשר למשתמש לקבוע במדויק את קצב התחלת המוות התאי על ידי הדמיה רציפה של עלים מחוסנים בזמן שבין התחלת המוות התא לבין הופעת המוות התאי באמצעות מיקרוסקופ דיגיטלי. למרות שישנן דרכים רבות לניטור התרחשות נגעים ומחלות צמחים12,13,14,15, פרוטוקול זה מציג את היתרון של מדידה שאינה תלויה באור מבלי להפריע לשעון הביולוגי של הצמח, מכיוון שהאור כבוי בין מדידות.
לאחר החיסון, צמחים צריכים לגדול ב 28 °C (78 °F) במשך 3 ימים. גן עמידות Ny-1 , המשרה תגובה רגישה, תלוי טמפרטורה, ובצמחים הגדלים בטמפרטורות גבוהות יותר, מוביל להפלה של עמידות, המתבטאת בחוסר היווצרות נגעים והתפשטות וירוס מערכתית3. לאחר העברת צמחים ל -22 מעלות צלזיוס, מוות תאי מתחיל, ולכן לקבלת תוצאות מדויקות, תצפית במיקרוסקופ דיגיטלי צריכה להתחיל בהקדם האפשרי לאחר העברה זו. שלב מכריע נוסף בהכנת הצמח לדימות הוא אימוביליזציה של העלה (איור 1D), מאחר שהצמח ימשיך לגדול במהלך ההדמיה, מה שעלול להוציא את העלה הנצפה ממיקוד, או שמיקום כזה לא ייתן את התוצאות הרצויות.
אם הפרוטוקול המתואר משמש על צמחים טרנסגניים עם מרכיבים שונים של עניין, משוער להיות מעורב בהתחלת מוות תאי, הפרוטוקול מאפשר למשתמש לקבוע אם הרמה הנמוכה של רכיב נחקר משפיעה על קצב התחלת מוות תאי. על ידי כך, ניתן לזהות רכיבים המעורבים בהתחלת מוות תאי בפתו-מערכות, שבהן מתרחש מוות תאי מתוכנת, באמצעות פרוטוקול זה. שיטות אחרות לזיהוי רכיבים אלה הן, למשל, ניתוח שעתוק כגון RNA-seq או צורות שונות של מיקרוסקופיה, אשר יכול להיות יקר זמןרב 16. השיטה המתוארת בפרוטוקול זה מאפשרת זיהוי קל וזול של רכיבים המעורבים בהתחלת מוות תאי על ידי התבוננות בהבדלים בשיעורי התחלת מוות תאי בין צמחים טרנסגניים לצמחי ביקורת. באופן אופטימלי, במערך כזה, יש להשתמש בשתי מצלמות דיגיטליות, שכן יש לנתח צמח מהונדס במקביל למפעל בקרה באותו ניסוי.
בפרוטוקול זה נעשה שימוש בזן PVY N-Wilga; עם זאת, זנים אחרים של וירוס זה, למשל, GFP מתויג PVY (PVY-N605(123)-GFP)7, יכול לשמש גם. יתר על כן, פתו-מערכות אחרות, הגורמות להתפתחות מוות תאי מתוכנת, יכולות להיחקר באמצעות פרוטוקול זה עם שינויים קלים.
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לברברה יקליץ’ על הסיוע הטכני. מחקר זה נתמך כספית על ידי סוכנות המחקר והחדשנות הסלובנית (מימון ליבת מחקר מס’ P4-0165 ופרויקט Z4-3217: פענוח קישוריות איתות הקשורה לחמצון-חיזור בעמידות תפוחי אדמה נגד וירוסים).
Alcohol burner | Mikro+Polo | SH-234002455 | For tweezers and scalpel sterilization |
Autoclave A-21 CAV | Kambi | N/A | |
Bacto Agar | Becton, Dickinson and Company | 214010 | |
Carborundum powder | VWR Chemicals | 22505297 | |
DinoCapture 2.0 | Dino-Lite | Version 2.0 | software for digital microscope |
Dino-Lite Edge AM7915MZTL digital microscope | AnMo Electronics Corporation | AM7915MZTL | |
Ethanol, 70% | Stella Tech | P94000 | For tweezers and scalpel sterilization |
Extraction bags | Bioreba | 420100 | |
Growth chamber FS-WI | Photon Systems Insturments | N/A | |
Hand homogenizer | Bioreba | 400010 | |
Hawita Special Substrate | HAWITA Gruppe | 2000000071701 | Ready to use substrate, made using peat (H4-H6 and H6-H8) |
Hydrochloric acid (HCl) | Merck | 109057 | |
Label tape | Sigma | L8144-5EA | |
Laptop computer with installed DinoCapture 2.0 | HP | Z2V77EA#BED | Computer needs to be transferable as experiment takes part in a growth chamber |
Murashige and Skoog medium | Duchefa Biochemie | M02220100 | |
Na2HPO4 | Emsure | 1065860500 | |
NaH2PO4 | Emsure | 1064700250 | |
Pasteur pipette 0.5 mL | Brand | 21500209 | |
pH-meter | Mettler Toledo | ML1601 | |
Plastic boxes | Cvetlice Dornig | VCG10.5 | Radius = 10.5 cm |
Plastic pots | Lab Associates | DIS40003 | Radius = 11.5 cm (top), Radius = 9.8 cm (bottom) |
Saccharose | Kemika d.d. | 1800408 | |
Sodium Diethyldithiocarbamate (DIECA) | Sigma-Aldeich | 228680 | Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate, ACS reagent |
Sodium hydroxide (NaOH) | Merck | 106462 | |
Sterile surgical blades | Braun | 4511733633 | |
Tweezers | Braun | BD033R |