Stimolazione multimodale automatizzata e registrazione neuronale simultanea da più piccoli organismi

Le tecniche di imaging del calcio hanno permesso la registrazione non invasiva delle dinamiche neurali in vivo in tempo reale utilizzando la microscopia a fluorescenza e indicatori di calcio geneticamente codificati espressi nelle cellule bersaglio ^1,2,3. Questi sensori utilizzano tipicamente una proteina fluorescente verde (GFP), come la famiglia di peptidi GFP-calmodulina-M13 (GCaMP), per aumentare l’intensità della fluorescenza dopo l’attivazione neuronale e livelli elevati di calcio intracellulare. L’imaging del calcio è stato particolarmente potente nel nematode C. elegans per esaminare come funzionano i neuroni e i circuiti neurali negli animali viventi e comportamentali 4,5,6,7,8,9,10^, poiché la loro natura trasparente significa che non è richiesto alcun processo chirurgico per l’accesso ottico e i promotori genici specifici delle cellule indirizzano l’espressione alle cellule di interesse. Queste tecniche fanno spesso uso di dispositivi microfluidici, che forniscono ambienti controllati con precisione per studiare fenomeni biologici, chimici e fisici su piccola scala fisica^11,12. I dispositivi microfluidici abbondano per misurare l’attività neurale, con nuovi progetti continuamente in fase di sviluppo e sono prontamente fabbricati nel laboratorio di ricerca. Tuttavia, molti progetti intrappolano un singolo animale alla volta, limitando il throughput sperimentale ^7,9,13. Le risposte neurali spesso variano sostanzialmente tra gli animali a causa di differenze nell’esperienza precedente, stati interni come stress o fame o fattori stocastici come i livelli di espressione genica. Queste differenze stabiliscono la necessità di metodi in grado di stimolare e osservare simultaneamente molti animali ed estrarre informazioni dagli individui⁴.

Inoltre, alcuni fenomeni neuromodulatori diventano evidenti solo in specifiche condizioni di stimolazione, come l’inibizione temporale¹⁴, che si riferisce alla breve soppressione delle risposte quando la stimolazione avviene in rapida successione. I sistemi elettrofisiologici possono guidare l’attività neurale attraverso un ampio spazio di stimolo per questo scopo, modulando, ad esempio, la corrente dell’impulso elettrico, la tensione, la frequenza, la forma d’onda, il ciclo di lavoro e la temporizzazione dei treni di stimolo periodici. La stimolazione indiretta da parte di stimoli rilevati naturalmente o sistemi optogenetici trarrebbe beneficio da una simile ampiezza di meccanismi di controllo. Attualmente, molti stimoli naturali sono presentati in modo semplice “on-off”, come la presentazione e la rimozione degli odori, utilizzando sistemi commerciali che sono stati lenti ad aggiungere flessibilità. Tuttavia, i microcontrollori economici possono ora automatizzare la consegna di diversi tipi di stimoli in modo personalizzabile in base alle esigenze dei ricercatori. In combinazione con la microfluidica, questi sistemi hanno raggiunto l’obiettivo di aumentare la produttività sperimentale e la flessibilità, consentendo di misurare simultaneamente le risposte neurali a una varietà di stimoli precisi in molti animali ^4,6. La stimolazione multimodale può essere utilizzata per interrogare ulteriormente i circuiti neuronali, ad esempio monitorando i cambiamenti nell’eccitabilità neurale quando stimolano costantemente prima, durante e dopo una perturbazione ortogonale come l’esposizione al farmaco⁴. I vantaggi dei sistemi di microscopia aperti ed economici sono chiari per far progredire la ricerca scientifica, ma in pratica, la necessità di approvvigionamento delle parti, costruzione e convalida delle prestazioni può impedire l’adozione di queste tecniche.

Questo protocollo mira ad alleviare alcune di queste sfide tecniche. Mentre i protocolli precedenti si sono concentrati sull’uso di dispositivi microfluidici e sulla stimolazione di base 9,15,17, descriviamo qui la costruzione e l’uso di un sistema di somministrazione di stimoli flessibile^, automatizzato e multimodale per l’imaging neurale in C. elegans o altri piccoli organismi che utilizzano dispositivi microfluidici precedentemente descritti 4. Il sistema open source è programmato tramite semplici file di testo per definire gli esperimenti e il programma di analisi dei dati NeuroTracker estrae semi-automaticamente i dati dell’attività neurale dai video del microscopio. Dimostriamo questo sistema con esempi di valutazione dell’inibizione temporale, della disinibizione e della diafonia dello stimolo usando il neurone chemiosensoriale AWA, che depolarizza in risposta a diversi odori alimentari o in risposta alla luce quando esprime i canali ionici optogenetici sensibili alla luce ^5,6.