Estimulación multimodal automatizada y registro neuronal simultáneo de múltiples organismos pequeños

Las técnicas de imagen de calcio han permitido el registro no invasivo de la dinámica neuronal in vivo en tiempo real utilizando microscopía de fluorescencia e indicadores de calcio codificados genéticamente expresados en células diana ^1,2,3. Estos sensores suelen utilizar una proteína fluorescente verde (GFP), como la familia de péptidos GFP-calmodulina-M13 (GCaMP), para aumentar la intensidad de fluorescencia tras la activación neuronal y los niveles elevados de calcio intracelular. Las imágenes de calcio han sido especialmente poderosas en el nematodo C. elegans para examinar cómo funcionan las neuronas y los circuitos neuronales en animales vivos, comportándose 4,5,6,7,8,9,10, ya que su naturaleza transparente significa que no se requiere ningún proceso quirúrgico para el acceso óptico^, y los promotores de genes específicos de células dirigen la expresión a las células de interés. Estas técnicas a menudo hacen uso de dispositivos microfluídicos, que proporcionan ambientes controlados con precisión para estudiar fenómenos biológicos, químicos y físicos a pequeña escala física^11,12. Los dispositivos microfluídicos abundan para medir la actividad neuronal, con nuevos diseños continuamente en desarrollo, y se fabrican fácilmente en el laboratorio de investigación. Sin embargo, muchos diseños atrapan a un solo animal a la vez, limitando el rendimiento experimental ^7,9,13. Las respuestas neuronales a menudo varían sustancialmente entre los animales debido a diferencias en la experiencia previa, estados internos como el estrés o el hambre, o factores estocásticos como los niveles de expresión génica. Estas diferencias establecen la necesidad de métodos que puedan estimular y observar simultáneamente muchos animales y extraer información de los individuos⁴.

Además, ciertos fenómenos neuromoduladores se hacen evidentes sólo bajo condiciones específicas de estimulación, como la inhibición temporal¹⁴, que se refiere a la breve supresión de las respuestas cuando la estimulación ocurre en rápida sucesión. Los sistemas electrofisiológicos pueden impulsar la actividad neuronal a través de un amplio espacio de estímulo para este propósito, modulando, por ejemplo, la corriente de pulso eléctrico, el voltaje, la frecuencia, la forma de onda, el ciclo de trabajo y la sincronización de los trenes de estímulos periódicos. La estimulación indirecta por estímulos detectados naturalmente o sistemas optogenéticos se beneficiaría de una amplitud similar de mecanismos de control. Actualmente, muchos estímulos naturales se presentan de una manera simple “on-off”, como la presentación y eliminación de olores, utilizando sistemas comerciales que han tardado en agregar flexibilidad. Sin embargo, los microcontroladores de bajo costo ahora pueden automatizar la entrega de varios tipos de estímulos de una manera que se puede personalizar según las necesidades de los investigadores. Combinados con la microfluídica, estos sistemas han logrado el objetivo de aumentar el rendimiento experimental y la flexibilidad, permitiendo que las respuestas neuronales a una variedad de estímulos precisos se midan simultáneamente en muchos animales ^4,6. La estimulación multimodal se puede utilizar para interrogar aún más los circuitos neuronales, por ejemplo, mediante el monitoreo de los cambios en la excitabilidad neuronal cuando se estimula consistentemente antes, durante y después de una perturbación ortogonal como la exposición a drogas⁴. Los beneficios de los sistemas de microscopía abiertos y económicos son claros para avanzar en la investigación científica, pero en la práctica, la necesidad de abastecimiento de piezas, construcción y validación del rendimiento puede impedir la adopción de estas técnicas.

Este protocolo tiene como objetivo aliviar algunos de estos desafíos técnicos. Mientras que los protocolos anteriores se han centrado en el uso de dispositivos microfluídicos y la estimulación básica 9,15,17, describimos aquí la construcción y el uso de un sistema de administración de estímulos flexible^, automatizado y multimodal para imágenes neuronales en C. elegans u otros organismos pequeños utilizando dispositivos microfluídicos previamente descritos⁴. El sistema de código abierto está programado a través de archivos de texto simples para definir los experimentos, y el programa de análisis de datos NeuroTracker extrae semiautomáticamente los datos de actividad neuronal de los videos del microscopio. Demostramos este sistema con ejemplos de evaluación de la inhibición temporal, la desinhibición y la diafonía de estímulos utilizando la neurona quimiosensorial AWA, que se despolariza en respuesta a diferentes olores de alimentos o en respuesta a la luz al expresar canales iónicos optogenéticos sensibles a la luz ^5,6.