Este artículo describe la medición semiautomática de las amplitudes y latencias de los primeros cinco picos y valles en la forma de onda de respuesta auditiva del tronco encefálico. Una rutina adicional compila y anota los datos en una hoja de cálculo para el análisis del experimentador. Estas rutinas informáticas gratuitas se ejecutan utilizando el paquete estadístico de código abierto R.
Muchos informes en los últimos 15 años han evaluado los cambios en la forma de onda de la respuesta auditiva del tronco encefálico (ABR) después de insultos como la exposición al ruido. Los cambios comunes incluyen reducciones en la amplitud del pico 1 y las latencias relativas de los picos posteriores, así como una mayor ganancia central, que se refleja en un aumento relativo en las amplitudes de los picos posteriores en comparación con la amplitud del pico 1. Muchos experimentadores identifican los picos y valles visualmente para evaluar sus alturas y latencias relativas, que es un proceso laborioso cuando las formas de onda se recogen en incrementos de 5 dB en todo el rango de audición para cada frecuencia y condición. Este documento describe rutinas libres que pueden ejecutarse en la plataforma de código abierto R con la interfaz RStudio para semiautomatizar las mediciones de los picos y valles de las formas de onda de la respuesta auditiva del tronco encefálico (ABR). Las rutinas identifican las amplitudes y latencias de los picos y valles, las muestran en una forma de onda generada para su inspección, recopilan y anotan los resultados en una hoja de cálculo para el análisis estadístico y generan formas de onda promediadas para las figuras. En los casos en que el proceso automatizado identifica erróneamente la forma de onda ABR, existe una herramienta adicional para ayudar en la corrección. El objetivo es reducir el tiempo y el esfuerzo necesarios para analizar la forma de onda ABR para que más investigadores incluyan estos análisis en el futuro.
La respuesta auditiva del tronco encefálico (ABR) se utiliza con frecuencia para determinar los umbrales de audición en sujetos animales y bebés humanos. Como el ABR es un registro de electroencefalograma (EEG) de las primeras respuestas del sistema nervioso a los estímulos auditivos, lleva información adicional que refleja el disparo coordinado de las neuronas ganglionares espirales cocleares y el procesamiento temprano de señales en el tronco cerebral auditivo, incluido el procesamiento bilateral1. Estas respuestas pueden verse afectadas por el trauma del ruido. Por ejemplo, la exposición al ruido que es suficiente para inducir un cambio temporal del umbral en ratones también puede reducir permanentemente la amplitud del pico ABR 12. Además, tal trauma puede reducir las latencias entre picos y aumentar las amplitudes relativas de los picos posteriores3, posiblemente debido a una pérdida de regulación inhibitoria4. Además de estos hallazgos, se ha demostrado que mutaciones genéticas específicas alteran la forma de onda ABR en ausencia de trauma 5,6,7. Por lo tanto, el análisis rutinario de las formas de onda ABR puede proporcionar información sobre el sistema auditivo en modelos experimentales.
También ha habido interés en el uso de formas de onda ABR como una herramienta de diagnóstico para los pacientes. Informes anteriores han evaluado si el pico 1 de ABR se reduce en pacientes humanos después de la exposición al ruido o en pacientes con tinnitus 8,9. En particular, se ha informado que los ataques de migraña aumentan temporalmente las latencias entre picos durante varias semanas, después de lo cual la forma de onda ABR vuelve a la normalidad en los individuos afectados10. Se ha informado que COVID-19 impulsa alteraciones a largo plazo en las latencias interpico ABR11,12, aunque otro estudio reportó resultados diferentes 13. La pérdida de audición es a menudo comórbida con la demencia en el envejecimiento, y las personas con mayor pérdida auditiva tienden a experimentar demencia que avanza más rápidamente14. Los investigadores han investigado los cambios en la forma de onda ABR en enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Parkinson (revisada en Jafari et al.15) y la enfermedad de Alzheimer (revisada en Swords et al.16), así como en el envejecimiento normal 17. A medida que más investigadores y médicos investigan los déficits sensoriales como biomarcadores de enfermedades comunes en el envejecimiento, técnicas como ABR pueden convertirse en rutina en la atención médica.
Un examen de las secciones de métodos en la literatura revela que los laboratorios a menudo escriben scripts personalizados en MatLab para analizar formas de onda ABR. La plataforma ABR fabricada por Intelligent Hearing Systems tiene una función para el análisis de forma de onda, pero requiere que un operador seleccione manualmente los picos y valles. Aquí, hemos escrito rutinas de análisis semiautomatizadas para el entorno estadístico de código abierto y disponible gratuitamente R y la interfaz RStudio. Este informe compara los datos obtenidos utilizando nuestras rutinas con los datos obtenidos al hacer que un experimentador identifique manualmente los picos y valles y muestra que los datos de los dos métodos están fuertemente correlacionados. Es importante destacar que las rutinas incorporan una función de cegamiento, en la que los metadatos de las muestras se colocan en un archivo separado que no se incorpora hasta el final. Estas funciones han simplificado el análisis de forma de onda para nuestro laboratorio.
El protocolo descrito en esta publicación debería ayudar a agilizar la adquisición de datos que describen las relaciones de amplitud de voltaje y los intervalos de latencia para ABR a clics y pips de tono. Al emplear comandos individuales en RStudio, un experimentador puede extraer, compilar y mostrar esta información en un solo documento para el análisis estadístico. Al hacer que este análisis sea rutinario, esperamos que el campo descubra nuevas formas en que el ABR puede ser alterado en el desarrollo, en el envejecimiento o por insulto en diferentes especies. Tal información podría ser valiosa para identificar mecanismos importantes similares a la sinaptopatía del ruido2. Los ratones jóvenes utilizados para este experimento tuvieron respuestas muy variables, probablemente porque el tronco cerebral auditivo todavía está madurando a esta edadde 20 años. No obstante, los dos métodos de cuantificación mostraron correlaciones muy fuertes (Figura 2).
El script utiliza un archivo llamado “Time.csv” para establecer intervalos dentro de los datos para la identificación de picos. Brevemente, una amplitud de voltaje máxima que ocurre en un intervalo de tiempo especificado se etiqueta como “pico 1”, un voltaje mínimo que ocurre en el siguiente intervalo se etiqueta como “valle 1”, y así sucesivamente. Elegimos los intervalos para abarcar las latencias de las respuestas de pip de clic y tono para ratones CBA / CaJ de 1 mes a 12 meses de edad utilizando frecuencias que abarcan 8 kHz a 32 kHz. Utilizamos con éxito la herramienta para medir también las respuestas de pip de tono en ratones. Otras especies, incluidos los humanos, también tienen respuestas ABR dentro de ventanas similares, y anticipamos que esta herramienta también se puede usar para datos de otras especies. Recomendamos utilizar el nuevo método ABR paralelo para humanos21, que produce excelentes formas de onda. La limitación del intervalo de tiempo restringe el uso de esta herramienta a la evaluación de las respuestas inmediatas de ABR. Sin embargo, observamos que los datos de intervalo en este archivo podrían ser alterados por los usuarios para automatizar las mediciones de las respuestas ABR al habla o de los potenciales relacionados con eventos (ERP) que ocurren característicamente en diferentes momentos en respuesta al sonido.
Cabe destacar algunas características del tratamiento estadístico de estos datos. Hasta donde sabemos, el campo no tiene un tratamiento estandarizado para distinguir las progresiones de amplitud. Los primeros estudios utilizaron ANOVA22,23. Los datos de la serie de clics aquí (Figura 2) no fueron paramétricos, lo que llevó al uso de la prueba de suma de rangos de Kruskal-Wallis. Similar al ANOVA, la prueba de suma de rangos de Kruskal-Wallis evalúa las diferencias en los valores obtenidos en un nivel dado de un estímulo; es decir, compara las líneas obtenidas en el gráfico. Sin embargo, otros tratamientos también son posibles. Biológicamente, las progresiones de amplitud reflejan el reclutamiento adicional de neuronas de umbral más alto a medida que aumenta el nivel de estímulo. Esto sugiere que el área bajo la curva, que representa las integrales de las líneas, podría ser la medida más relevante. Las ecuaciones de estimación generalizadas (GEE) pueden utilizarse para modelar datos individuales para un análisis integral, como en Patel et al.5. En particular, el análisis GEE puede tener en cuenta el diseño de medidas repetidas de estos experimentos. A medida que más investigadores discutan los métodos de análisis de datos, anticipamos el surgimiento de un consenso sobre las mejores prácticas.
En conclusión, este documento presenta herramientas gratuitas y fáciles de usar para medir, compilar y visualizar formas de onda ABR. Estas herramientas pueden ser utilizadas por estudiantes novatos de RStudio siguiendo este protocolo, e incorporan un paso cegador para mejorar el rigor y la reproducibilidad. Prevemos que el análisis rutinario de la forma de onda ABR permitirá el descubrimiento de insultos, variantes genéticas y otros tratamientos que pueden afectar la función auditiva.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por dos subvenciones del NIDCD a PW: R01 DC018660 y un premio administrativo suplementario, R01 DC014261-05S1.
C57BL/6J mice | Jackson Labs | 664 | |
CBA/CaJ mice | Jackson Labs | 654 | |
E-series PC | Dell | n/a (this equipment was discontinued) | This runs the IHS system. |
Mini-anechoic chamber | Industrial Acoustics Company | Special order number 104306 | This enclosure reduces noise levels for auditory testing of animals. |
Optiplex 7040 | Dell | i5-6500 | Rstudio may also be run on a Mac or Linux system. |
Universal Smart Box | Intelligent Hearing Systems | n/a (this equipment was discontinued) | Both TDT and IHS can output hearing data as ASCII files. |