Este artigo descreve a mensuração semi-automatizada das amplitudes e latências dos cinco primeiros picos e vales na forma de onda de resposta auditiva do tronco encefálico. Uma rotina adicional compila e anota os dados em uma planilha para análise do experimentador. Essas rotinas de computador gratuitas são executadas usando o pacote estatístico de código aberto R.
Muitos relatos nos últimos 15 anos avaliaram mudanças na forma de onda da resposta auditiva do tronco encefálico (PEATE) após insultos como a exposição ao ruído. Mudanças comuns incluem reduções na amplitude do pico 1 e nas latências relativas dos picos posteriores, bem como aumento do ganho central, que é refletido por um aumento relativo nas amplitudes dos picos posteriores em comparação com a amplitude do pico 1. Muitos experimentadores identificam os picos e vales visualmente para avaliar suas alturas e latências relativas, o que é um processo trabalhoso quando as formas de onda são coletadas em incrementos de 5 dB em toda a faixa auditiva para cada frequência e condição. Este trabalho descreve rotinas livres que podem ser executadas na plataforma de código aberto R com a interface RStudio para semi-automatizar as medidas dos picos e vales das formas de onda da resposta auditiva do tronco encefálico (PEATE). As rotinas identificam as amplitudes e latências de picos e vales, as exibem em uma forma de onda gerada para inspeção, agrupam e anotam os resultados em uma planilha para análise estatística e geram formas de onda médias para figuras. Nos casos em que o processo automatizado identifica erroneamente a forma de onda ABR, há uma ferramenta adicional para auxiliar na correção. O objetivo é reduzir o tempo e o esforço necessários para analisar a forma de onda do PEATE para que mais pesquisadores incluam essas análises no futuro.
A resposta auditiva do tronco encefálico (PEATE) é frequentemente usada para determinar limiares auditivos em animais e bebês humanos. Como o PEATE é um registro de eletroencefalograma (EEG) das primeiras respostas do sistema nervoso a estímulos auditivos, ele carrega informações adicionais que refletem o disparo coordenado de neurônios ganglionares espirais cocleares e o processamento precoce de sinais no tronco encefálico auditivo, incluindo o processamento bilateral1. Essas respostas podem ser afetadas pelo trauma do ruído. Por exemplo, a exposição ao ruído que é suficiente para induzir uma mudança temporária do limiar em camundongos também pode reduzir permanentemente a amplitude do pico do PEATE 12. Além disso, esse trauma pode reduzir as latências interpicos e aumentar as amplitudes relativas dos picos posteriores3, possivelmente devido à perda da regulação inibitória4. Além desses achados, mutações genéticas específicas têm demonstrado alterar a forma de onda do PEATE na ausência de trauma 5,6,7. Assim, a análise rotineira das formas de onda do PEATE pode fornecer informações sobre o sistema auditivo em modelos experimentais.
Também tem havido interesse em usar formas de onda do PEATE como uma ferramenta diagnóstica para os pacientes. Relatos prévios avaliaram se o pico 1 do PEATE está reduzido em pacientes humanos após exposição ao ruído ou em pacientes comzumbido 8,9. Notavelmente, os ataques de enxaqueca têm sido relatados para aumentar temporariamente as latências interpicos por várias semanas, após o que a forma de onda do PEATE retorna ao normal em indivíduos afetados10. A COVID-19 tem sido relatada como impulsionando alterações de longo prazo nas latências interpicos do PEATE 11,12, embora outro estudo tenha relatado resultados diferentes13. A perda auditiva é muitas vezes co-mórbida com a demência no envelhecimento, e indivíduos com maior perda auditiva tendem a experimentar demência que avança mais rapidamente14. Pesquisadores investigaram alterações na forma de onda do PEATE em doenças neurodegenerativas, como a doença de Parkinson (revisada em Jafari et al.15) e a doença de Alzheimer (revisada em Swords et al.16), bem como no envelhecimento normal 17. À medida que mais pesquisadores e clínicos investigam déficits sensoriais como biomarcadores para doenças comuns no envelhecimento, técnicas como o PEATE podem se tornar rotineiras nos cuidados de saúde.
Um exame das seções de métodos na literatura revela que os laboratórios geralmente escrevem scripts personalizados no MatLab para analisar formas de onda ABR. A plataforma ABR feita pela Intelligent Hearing Systems tem uma função para análise de forma de onda, mas requer que um operador selecione manualmente os picos e vales. Aqui, escrevemos rotinas de análise semi-automatizadas para o ambiente estatístico de código aberto e disponível gratuitamente R e a interface RStudio. Este relatório compara os dados obtidos usando nossas rotinas com os dados obtidos por um experimentador identificar manualmente os picos e vales e mostra que os dados dos dois métodos estão fortemente correlacionados. É importante ressaltar que as rotinas incorporam uma função de cegamento, na qual os metadados das amostras são colocados em um arquivo separado que não é incorporado até o final. Essas funções simplificaram a análise de formas de onda para o nosso laboratório.
O protocolo descrito nesta publicação deve ajudar a agilizar a aquisição de dados que descrevem as razões de amplitude de tensão e os intervalos de latência de ABRs para cliques e pips de tom. Ao empregar comandos únicos no RStudio, um experimentador pode extrair, compilar e exibir essas informações em um único documento para análise estatística. Ao tornar essa análise rotineira, esperamos que o campo descubra novas maneiras pelas quais o PEATE pode ser alterado no desenvolvimento, no envelhecimento ou por insulto em diferentes espécies. Tais informações podem ser valiosas para a identificação de mecanismos importantes semelhantes à sinaptopatia a partir do ruído2. Os ratos jovens utilizados para este experimento tiveram respostas altamente variáveis, provavelmente porque o tronco encefálico auditivo ainda está amadurecendo nesta idade20. No entanto, os dois métodos de quantificação apresentaram correlações muito fortes (Figura 2).
O script usa um arquivo chamado “Time.csv” para definir intervalos dentro dos dados para identificação de pico. Resumidamente, uma amplitude de tensão máxima que ocorre em um intervalo de tempo especificado é rotulada como “pico 1”, uma tensão mínima que ocorre no intervalo seguinte é rotulada como “vale 1” e assim por diante. Optou-se pelos intervalos para abranger as latências das respostas de clique e tone pip para camundongos CBA/CaJ com idade entre 1 mês e 12 meses de idade, usando frequências que abrangem 8 kHz a 32 kHz. Usamos com sucesso a ferramenta para também medir as respostas do pip de tom em camundongos. Outras espécies, incluindo os seres humanos, também têm respostas de PEATE dentro de janelas semelhantes, e antecipamos que essa ferramenta também possa ser usada para dados de outras espécies. Recomendamos o uso do novo método ABR paralelo para humanos21, que produz excelentes formas de onda. A limitação do intervalo de tempo restringe o uso dessa ferramenta para avaliar as respostas imediatas do PEATE. Observamos, no entanto, que os dados de intervalo neste arquivo podem ser alterados pelos usuários para automatizar as medidas das respostas do PEATE à fala ou dos potenciais relacionados a eventos (ERPs) que caracteristicamente ocorrem em momentos diferentes em resposta ao som.
Algumas características do tratamento estatístico desses dados merecem destaque. Até onde sabemos, o campo não possui um tratamento padronizado para distinguir progressões de amplitude. Os primeiros estudos utilizaram ANOVA22,23. Os dados da série de cliques aqui (Figura 2) não foram paramétricos, levando à utilização do teste de soma de postos de Kruskal-Wallis. Semelhante à ANOVA, o teste de soma de postos de Kruskal-Wallis avalia as diferenças nos valores obtidos em um determinado nível de um estímulo; ou seja, compara as linhas obtidas no gráfico. No entanto, outros tratamentos também são possíveis. Biologicamente, as progressões de amplitude refletem o recrutamento adicional de neurônios de limiar mais alto à medida que o nível de estímulo aumenta. Isso sugere que a área sob a curva, que representa as integrais das linhas, poderia ser a medida mais relevante. Equações de estimação generalizada (GEE) podem ser utilizadas para modelar dados individuais para uma análise integral, como em Patel et al.5. Notavelmente, a análise GEE pode levar em consideração o projeto de medidas repetidas desses experimentos. À medida que mais pesquisadores discutem os métodos de análise de dados, antecipamos o surgimento de um consenso sobre as melhores práticas.
Em conclusão, este artigo apresenta ferramentas gratuitas e fáceis de usar para medir, compilar e visualizar formas de onda do PEATE. Essas ferramentas podem ser usadas por estudantes novatos do RStudio seguindo este protocolo, e incorporam um passo ofuscante para melhorar o rigor e a reprodutibilidade. Prevemos que a análise rotineira da forma de onda do PEATE permitirá a descoberta de insultos, variantes genéticas e outros tratamentos que podem afetar a função auditiva.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado por duas subvenções do NIDCD à PW: R01 DC018660 e uma atribuição administrativa complementar, R01 DC014261-05S1.
C57BL/6J mice | Jackson Labs | 664 | |
CBA/CaJ mice | Jackson Labs | 654 | |
E-series PC | Dell | n/a (this equipment was discontinued) | This runs the IHS system. |
Mini-anechoic chamber | Industrial Acoustics Company | Special order number 104306 | This enclosure reduces noise levels for auditory testing of animals. |
Optiplex 7040 | Dell | i5-6500 | Rstudio may also be run on a Mac or Linux system. |
Universal Smart Box | Intelligent Hearing Systems | n/a (this equipment was discontinued) | Both TDT and IHS can output hearing data as ASCII files. |