Concanavalin A-basierter Sedimentationsassay zur Messung der Substratbindung von Glucanphosphatasen

Glucan-Phosphatasen sind Mitglieder einer funktionell vielfältigen Unterfamilie von Dual-Spezifitäts-Phosphatasen (DSPs) innerhalb der Protein-Tyrosin-Phosphatase (PTP)-Superfamilie¹. Sie wurden in den meisten Lebensformen gefunden, einschließlich sehr unterschiedlicher photosynthetischer Organismen, Menschen, Wirbeltieren und einigen wirbellosen Tieren und Protisten ^2,3,4. Pflanzen enthalten drei bekannte Glucan-Phosphatasen: Stärkeüberschuss4 (SEX4), Like Sex Four1 (LSF1) und Like Sex Four2 (LSF2)^5,6,7. Pflanzen, denen Glucanphosphatasen fehlen, zeigen eine verringerte Rate des vorübergehenden Stärkeabbaus und der Anreicherung von Stärke in den Blättern ^8,9. Laforin ist das Gründungsmitglied der Glucan-Phosphatase-Familie, die Glykogen bei Wirbeltieren und Menschen dephosphoryliert ^3,10. Die Mutationen von Laforin führen zur neurodegenerativen Lafora-Krankheit, einer tödlich verlaufenden autosomal-rezessiven Form der Epilepsie¹¹. Glucanphosphatasen sind für den Glykogen- und Stärkestoffwechsel notwendig und haben sich als wichtige Enzyme für die Modulation des Stärkegehalts in Pflanzen und die Behandlung der neurodegenerativen Lafora-Krankheit herauskristallisiert^12,13. Neuere Röntgenkristallographie-Untersuchungen an Glucanphosphatasen mit Modell-Glucan-Substraten haben Aufschluss über die Substratbindung und den katalytischen Mechanismus der Glucan-Dephosphorylierung^{gegeben 14,15,16,17}. Das derzeitige Verständnis darüber, wie Glucanphosphatasen an ihre physiologischen Substrate binden, ist jedoch unvollständig.

Stärke ist ein unlösliches Glukosepolymer, das zu 80%-90% aus Amylopektin und zu 10%-20% aus Amylose^{besteht 18}. Die Substrate für pflanzliche Glucanphosphatasen sind phosphorylierte Kohlenhydratmoleküle wie Glykogen- und Stärkekörner. Die phosphorylierten Glucosylreste liegen in einem Phosphat:Glucosyl-Restverhältnis von 1:600 vor. Interessanterweise sind die Phosphate nur auf den Amylopektinmolekülen¹⁹ vorhanden. Die pflanzliche Haupt-Glucan-Phosphatase SEX4 wirkt auf die Stärkekörner, um Amylopektinmoleküle zu dephosphorylieren. Die Röntgenkristallstruktur von SEX4 in Kombination mit strukturgesteuerten Mutagenesestudien hat die einzigartigen Substratspezifitäten von SEX4 für verschiedene Positionen innerhalb einer Glucanstruktur gezeigt¹⁵. Kürzlich konnten wir zeigen, dass die biologisch relevante Aktivität von SEX4 nur beobachtet werden kann, wenn es auf seine solubilisierten Amylopektinsubstrate^{einwirkt 20}. Das Verständnis der Glucan-SEX4-Wechselwirkungen hat sich jedoch aufgrund der strukturellen Komplexität des Substrats, der breiteren Bindungsspezifität und der geringen Bindungsaffinitäten zwischen dem Protein und seinen Substraten als schwierig erwiesen. Diese Probleme haben die Fähigkeit behindert, Methoden zu nutzen, die üblicherweise in Protein-Ligand-Interaktionen verwendet werden, wie z. B. die isotherme Titrationskalorimetrie (ITC), die Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) und ELISA-basierte Assays (Enzyme-linked Immunosorbent Assay).

Interessanterweise stammt ein Großteil unseres Verständnisses der Kohlenhydrat-Protein-Wechselwirkungen aus der Untersuchung von Lektinen. Concanavalin A (ConA) ist eine Familie von Leguminosen-Lektinen, die ursprünglich aus der Jackbohne gewonnen wurden. ConA bindet Kohlenhydrate mit hoher Spezifität, was für den Einsatz in Drug-Targeting- und Drug-Delivery-Anwendungen von Vorteil ist. Die Bindung von ConA an eine Vielzahl von Substraten, die nicht-reduzierendes α-D-Mannosyl und α-D-Glucosyl enthalten, wurde umfassend untersucht^19,20. Kommerziell erhältliche ConA-gebundene Sepharose-Kügelchen werden üblicherweise zur Reinigung von Glykoproteinen und Glykolipiden verwendet²¹. ConA bindet an diese Glucane über C3-, C4- und C6-Hydroxylgruppen der Glukosereste. ConA-Sepharose-Beads wurden auch erfolgreich verwendet, um die Bindung von Glykogen-Protein- und Stärke-Protein-Wechselwirkungen zu messen^22,23. In dieser Studie haben wir ConA-Sepharose-Beads verwendet, um einen Bindungsassay zu entwickeln, um die Bindungsspezifität von Glucan-Phosphatase-Amylopektin-Interaktionen zu messen.

Zuvor wurde ein ConA-basierter Sedimentationsassay verwendet, um die Bindungsfähigkeit des Glucanphosphatase-Substrats zu beurteilen^14,20,24. In dieser Arbeit wurde die gleiche Strategie verwendet, um eine neuartige Methode zur Bestimmung der Bindungsaffinität von Glucan-Glucan-Phosphatase- und Kohlenhydrat-Interaktionen zu entwickeln. Diese Methode hat auch einen Vorteil für die Untersuchung verschiedener solubilisierter Kohlenhydrat-Protein-Wechselwirkungen.