La microscopia a super-risoluzione può fornire una visione dettagliata dell’organizzazione dei componenti all’interno del complesso sinaptonemale nella meiosi. Qui, dimostriamo un protocollo per risolvere le singole proteine del complesso sinaptonemale Caenorhabditis elegans .
Durante la meiosi, i cromosomi omologhi devono riconoscersi e aderire l’uno all’altro per consentire la loro corretta segregazione. Uno degli eventi chiave che assicura l’interazione dei cromosomi omologhi è l’assemblaggio del complesso sinaptonemale (SC) nella profase meiotica I. Anche se c’è poca omologia di sequenza tra i componenti proteici all’interno della SC tra le diverse specie, la struttura generale della SC è stata altamente conservata durante l’evoluzione. Nelle micrografie elettroniche, la SC appare come una struttura tripartita, simile a una scala, composta da elementi laterali o assi, filamenti trasversali e un elemento centrale.
Tuttavia, identificare con precisione la localizzazione dei singoli componenti all’interno del complesso mediante microscopia elettronica per determinare la struttura molecolare della SC rimane difficile. Al contrario, la microscopia a fluorescenza consente l’identificazione di singoli componenti proteici all’interno del complesso. Tuttavia, poiché l’SC è largo solo ~ 100 nm, la sua sottostruttura non può essere risolta dalla microscopia a fluorescenza convenzionale limitata dalla diffrazione. Pertanto, la determinazione dell’architettura molecolare della SC richiede tecniche di microscopia ottica a super-risoluzione come la microscopia a illuminazione strutturata (SIM), la microscopia a deplezione a emissione stimolata (STED) o la microscopia a localizzazione a singola molecola (SMLM).
Per mantenere la struttura e le interazioni dei singoli componenti all’interno della SC, è importante osservare il complesso in un ambiente vicino al suo ambiente nativo nelle cellule germinali. Pertanto, dimostriamo un protocollo di immunoistochimica e imaging che consente lo studio della sottostruttura della SC in tessuto germinale intatto ed estruso di Caenorhabditis elegans con microscopia SMLM e STED. Il fissaggio diretto del tessuto al vetrino riduce il movimento dei campioni durante l’imaging e riduce al minimo le aberrazioni nel campione per ottenere l’alta risoluzione necessaria per visualizzare la sottostruttura del SC nel suo contesto biologico.
Ridurre il numero di cromosomi della metà durante la meiosi è la chiave per generare una progenie sana negli organismi che si riproducono sessualmente. Per ottenere questa riduzione del numero di cromosomi, i cromosomi omologhi devono accoppiarsi e segregare durante la meiosi I. Per garantire l’accurata segregazione dei cromosomi omologhi, le cellule germinali subiscono una profase I estesa, durante la quale i cromosomi omologhi si accoppiano, sinapsi e si ricombinano per generare collegamenti fisici tra omologhi1. La SC è emersa come la struttura centrale che è la chiave per regolare la corretta progressione attraverso la profase meiotica2.
La SC è un complesso la cui struttura generale è evolutivamente conservata, anche se c’è poca omologia tra le sue componenti proteiche. La SC è stata identificata per la prima volta nelle micrografie elettroniche come una struttura tripartita, simile a una scala, costituita da due elementi laterali o assi, una regione centrale formata da filamenti trasversali e un elemento centrale 3,4. Determinare l’organizzazione dei singoli componenti all’interno del complesso è la chiave per far progredire la nostra comprensione del ruolo del SC durante la profase meiotica.
L’organismo modello C. elegans è ideale per studiare la struttura e la funzione della SC poiché le sue linee germinali contengono un gran numero di nuclei meiotici con SC 5 completamente assemblati. Studi genetici e biochimici hanno rivelato che gli assi cromosomici sono formati da tre distinti complessi di coesina6,7 e quattro proteine del dominio HORMA chiamate HTP-1/2/3 e HIM-3 7,8,9,10,11 in C. elegans. Nella regione centrale del SC, sei proteine contenenti domini a spirale sono state identificate fino ad oggi 12,13,14,15,16,17. Per colmare la distanza tra i due assi, SYP-1, -5 e -6 dimerizzano in modo testa a testa (Figura 1), mentre tre proteine aggiuntive stabilizzano la loro interazione nell’elemento centrale16,17,18,19.
Ottenere informazioni dettagliate sull’organizzazione di queste proteine è essenziale per comprendere le molte funzioni della SC durante la meiosi. Poiché la larghezza della regione centrale del SC è solo ~ 100 nm, la sua sottostruttura non può essere risolta mediante microscopia a fluorescenza limitata dalla diffrazione. Tuttavia, la visualizzazione di componenti all’interno di una struttura di queste dimensioni è facilmente realizzabile con la microscopia a super-risoluzione. Infatti, la microscopia a illuminazione strutturata (SIM), la microscopia ad espansione 20, la microscopia a deplezione a emissione stimolata (STED)21 e la microscopia a localizzazione a singola molecola (SMLM)22,23 sono emerse come strumenti essenziali per studiare l’architettura molecolare della SC tra le specie 16,24,25,26,27,28,29, 30.
Per superare il limite di risoluzione, la microscopia STED si basa sulla sovrapposizione del punto limitato dalla diffrazione della luce di emissione con un raggio a forma di ciambella dal laser STED, che teoricamente restringe la funzione di diffusione del punto fino alle dimensioni molecolari31,32. Tuttavia, la risoluzione che è praticamente raggiungibile da STED all’interno di campioni biologici rimane nell’intervallo di poche decine di nanometri in xy33.
Una risoluzione ancora più elevata nei campioni biologici può essere ottenuta con le tecniche SMLM. SMLM sfrutta le proprietà lampeggianti di specifici fluorofori per risolvere oggetti a livello di sub-diffrazione separando nel tempo i fluorofori spazialmente sovrapposti. Il campione viene quindi ripreso ripetutamente per catturare diversi sottoinsiemi di fluorofori. La posizione dei fluorofori all’interno del campione viene quindi determinata adattando la funzione di diffusione puntuale (PSF) ai segnali ottenuti in tutte le immagini, che possono risolvere strutture fino a 15 nm 23,34.
Nel loro insieme, le immagini localizzate codificano le posizioni di tutti i fluorofori. La risoluzione di SMLM è determinata dalla densità di etichettatura e dalle caratteristiche lampeggianti del fluoroforo. Secondo il criterio di Nyquist-Shannon, è impossibile risolvere in modo affidabile oggetti che sono meno del doppio della distanza media da etichetta a etichetta. Pertanto, è necessaria un’elevata densità di etichettatura per l’imaging ad alta risoluzione. Per la SC in C. elegans, un’alta densità di marcatura può essere ottenuta utilizzando tag epitopi attaccati a siti specifici di proteine endogene utilizzando l’editing del genoma. Le etichette epitopiche possono quindi essere colorate ad alta densità utilizzando anticorpi monoclonali specifici con alta affinità19,30. Allo stesso tempo, il ciclo di accensione dei singoli fluorofori deve essere abbastanza breve da garantire che i fluorofori spazialmente sovrapposti non vengano catturati contemporaneamente35.
A causa di questi due requisiti, risolvere la struttura di grandi complessi macromolecolari come la SC richiede l’imaging di un numero sufficientemente grande di immagini e può quindi richiedere diverse ore. La trappola dei lunghi tempi di imaging è che i campioni tendono ad andare alla deriva a causa del movimento dello stadio o di piccole correnti all’interno del buffer del campione; Anche piccoli movimenti dell’ordine di 10 nm sono dannosi alla risoluzione nm e devono essere corretti. Tuttavia, i metodi di correzione della deriva comunemente usati non sono abbastanza robusti da sovrapporre accuratamente le immagini di due canali ripresi in sequenza36. Questo è problematico perché le domande biologiche spesso richiedono una rilevazione precisa e la localizzazione di più bersagli all’interno dello stesso campione. Per aggirare questi problemi, sono stati sviluppati metodi come l’imaging raziometrico. L’imaging raziometrico consente l’imaging simultaneo di più fluorofori con spettri di eccitazione ed emissione sovrapposti, con una successiva assegnazione di ciascun segnale rilevato al rispettivo fluoroforo in base al rapporto di intensità in canali spettralmente distinti37,38.
Inoltre, lo studio dell’organizzazione di complessi macromolecolari come la SC richiede informazioni tridimensionali (3D). Per ottenere una super-risoluzione in tre dimensioni (3D-SMLM), una lente cilindrica è incorporata nel percorso ottico della luce emessa che distorce la forma della PSF di un fluoroforo a seconda della sua distanza dal piano focale. Quindi, la posizione precisa di un fluoroforo nel piano z può essere estrapolata analizzando la forma del suo segnale di emissione35,39. La combinazione di questi progressi in SMLM consente l’imaging dell’organizzazione 3D di complessi macromolecolari, incluso il SC.
L’organizzazione a scala della SC, che è essenziale per la corretta ricombinazione e segregazione dei cromosomi omologhi, è stata osservata per la prima volta quasi 70 anni fa nella microscopia elettronica 3,4. Mentre l’organizzazione complessiva della SC è facilmente risolvibile al microscopio elettronico, la localizzazione dei singoli componenti all’interno di questo complesso richiede un approccio più mirato. Con la sua larghezza di soli ~ 100 nm, la sottostruttura della SC non può essere risolta dalla microscopia a fluorescenza convenzionale. Tuttavia, la microscopia a super-risoluzione è diventata un importante motore per nuove scoperte sulla struttura e la funzione del complesso sinaptonemale 16,19,24,25,26,27,28,29,30. Per facilitare questa ricerca, abbiamo dimostrato una procedura di montaggio che consente di studiare l’architettura della SC all’interno del tessuto gonadico di C. elegans con microscopia SMLM e STED.
Un passo fondamentale per ottimizzare la risoluzione nell’imaging SMLM è la reticolazione diretta del tessuto germinale a un coprivetrino rivestito di poli-L-lisina (fase 4). L’attacco covalente del tessuto al vetrino di copertura è essenziale per ridurre i movimenti all’interno del campione che si tradurrebbero in grandi derive e renderebbero impossibile l’imaging per lunghi periodi di tempo per SMLM. Inoltre, anche un attacco non ottimale che lascia i nuclei contenenti SC a una certa distanza dal vetrino di copertura porta ad un calo significativo della risoluzione ottenibile derivante da aberrazioni sferiche (Figura 4). In alternativa all’attacco covalente qui utilizzato, il tessuto germinale colorato può anche essere immobilizzato tra due vetrini sigillati in una piccola goccia di tampone di imaging19,30. Tuttavia, questo metodo di immobilizzazione riduce notevolmente il volume del tampone di imaging nel campione da 1 mL utilizzato nel protocollo ottimizzato qui a pochi μL, il che comporterà un’acidificazione del tampone di imaging e ridurrà gravemente il tempo per il quale il campione può essere ripreso 38,53,54.
I lunghi tempi di acquisizione sia per la microscopia SMLM che per la microscopia STED limitano l’uso di questi metodi all’imaging di campioni fissati chimicamente. Qui, la fissazione della paraformaldeide assicura che la struttura del SC sia preservata durante la preparazione del campione e l’imaging. Tuttavia, nonostante le precauzioni prese qui per visualizzare il SC all’interno di tessuto intatto, la struttura risultante della SC dopo la fissazione non è necessariamente identica alla struttura nel suo stato nativo all’interno di un organismo vivente. Inoltre, poiché una singola immagine del SC fisso rappresenta una singola “istantanea” della struttura biologica, questo approccio rimane cieco alla dinamica della struttura nativa in vivo.
Tuttavia, le informazioni sulla dinamica e la variabilità delle strutture macromolecolari possono essere ottenute anche acquisendo non una singola ma molte “istantanee”. Mentre questo approccio può risolvere i cambiamenti nella struttura del SC durante il pachitene19, ci sono diversi fattori che limitano il numero di immagini che possono essere acquisite da un singolo campione preparato utilizzando questo protocollo. In primo luogo, le elevate potenze laser utilizzate durante l’acquisizione delle immagini portano allo sbiancamento permanente dei fluorofori e precludono l’imaging di regioni adiacenti di interesse o piani z multipli, riducendo così significativamente il numero di immagini che possono essere acquisite da un singolo campione. In secondo luogo, la densità del campione/tessuto sul vetrino preparato con questo metodo è bassa, il che limita significativamente il numero di immagini che possono essere acquisite da un singolo vetrino. La bassa densità del campione vieta anche l’uso di pipeline di acquisizione automatica delle immagini che hanno contribuito a far luce su altre questioni biologiche 34,55,56,57,58,59. Tuttavia, la densità del campione può essere leggermente aumentata da un utente esperto.
Il protocollo qui presentato è ottimizzato per ottenere un’elevata densità di etichettatura necessaria per ottenere una risoluzione ottimale in SMLM35. Mentre i protocolli precedenti attaccano covalentemente il tessuto al vetrino prima dell’immunocolorazione16, questo nuovo protocollo collega il tessuto al vetrino solo dopo che i campioni sono stati colorati in soluzione. Questa modifica consente agli anticorpi utilizzati per l’immunomarcatura di accedere liberamente al tessuto da tutti i lati, mentre l’attaccamento covalente del tessuto al coprislip può impedire agli anticorpi di raggiungere i nuclei più vicini al vetrino, riducendo così il grado di etichettatura. Insieme, le modifiche qui descritte migliorano la risoluzione da 40-50 nm (risoluzione FRC)16 a 30-40 nm (questo protocollo).
È importante sottolineare che, mentre un’alta densità di etichettatura e un’alta concentrazione di anticorpi sono essenziali per SMLM, abbiamo scoperto che migliori immagini di microscopia STED sono ottenute utilizzando concentrazioni di anticorpi più basse (fase 3). Con una risoluzione di decine di nanometri, la dimensione delle molecole utilizzate per etichettare la proteina di interesse diventa sempre più importante. Abbiamo quindi impiegato frammenti F(ab’)2 che sono la metà delle dimensioni degli anticorpi a lunghezza intera. Il miglioramento del contrasto locale dovuto ad una sorgente di segnale più piccola, e quindi la risoluzione ottenuta da questa modifica rispetto all’utilizzo di anticorpi secondari full-length, ha permesso la risoluzione dei due C-termini di SYP-5 all’interno della regione centrale da parte di TauSTED, che non sono risolti da STED convenzionali utilizzando anticorpi full-length (16 e dati non mostrati). Prevediamo che questo protocollo ottimizzato per l’imaging di SC in linee germinali intatte di C. eleganfaciliterà lo studio della relazione struttura-funzione della SC durante la meiosi.
The authors have nothing to disclose.
Vorremmo ringraziare Jonas Ries e il laboratorio Ries per aver condiviso i buffer di imaging per l’imaging SMLM. Ringraziamo anche Yumi Kim per il ceppo C. elegans utilizzato in questo protocollo e Abby F. Dernburg per l’anticorpo pollo-anti-HTP-3. Ringraziamo Marko Lampe e Stefan Terjung dell’Advanced Light Microscopy Facility di EMBL Heidelberg per il loro supporto nell’utilizzo del microscopio confocale Olympus iXplore SPIN SR. Questo lavoro è stato sostenuto dal Laboratorio europeo di biologia molecolare e dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation – 452616889, SK). Riconosciamo l’accesso e i servizi forniti dal Centro di Imaging presso il Laboratorio Europeo di Biologia Molecolare (EMBL IC), generosamente sostenuto dalla Fondazione Boehringer Ingelheim.
100x/1.5 oil objective | Olympus | UPLAPO100XOHR | UPLAPO100XOHR |
2-mercaptoethylamine (MEA) | Sigma-Aldrich | 30070-10G | Dissolved in MilliQ water to 5 M solution, pH 8.7 adjusted with HCl. Aliquoted to a single-use volume, frozen, and kept at -80 °C. |
Additional 640 nm booster laser | Toptica | IBEAM-SMART-640-S-HP | |
AlexaFluor 594, NHS ester | ThermoFischer Scientific | A37572 | Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 °C |
AlexaFluor 647, NHS ester | ThermoFischer Scientific | A37573 | Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 °C |
anti-HA | Thermo Fisher Scientific | 2-2.2.14 | Mouse monoclonal, 1:250 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy) |
anti-HTP-3 | a gift from Abby F. Dernburg | MacQueen et al., 2005 | Chicken polyclonal, 1:250 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy) |
Caenorhabditis elegans strain YKM349 | a gift from Yumi Kim | Hurlock et al., 2020 | syp-5(kim9[syp-5::HA]) I; meIs8[pie-1p::GFP::cosa-1, unc-119(+)] II |
CF6680, NHS ester | Biotium | 92139 | Dissolved in DMSO to 1mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 °C |
Circular cover glass 12 mm No. 1 | Menzel-Gläser; VWR | 631-0713 | |
Circular cover glass 24 mm No. 1.5 | Carl Roth | PK26.1 | |
Cylindrical lenses | Thorlabs | LJ1516RM-A, LK1002RM-A | |
Egg Buffer (10x) | Edgar 1995 | 250 mM HEPES, 1.18 M NaCl, 480 mM KCl, 20 mM EDTA, 5 mM EGTA, pH 7.4 | |
Ethanol (absolute for analysis) | Merck | 64-17-5 | |
F(ab’)2 fragment anti-chicken IgY | Jackson Immunoresearch | AB_2340347 | Donkey polyclonal, 1:100 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy) |
F(ab’)2 fragment anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | AB_2340761 | Donkey polyclonal, 1:100 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy) |
Fisherbrand Microscope slides T/F Ground 0.8-1.0 mm thick | Fisher scientific | 7107 | |
Gauge Worm Pick 30 diameter 0.254 mm – Iridium 10% | Kisker | 789265 | |
Glucose oxidase/Catalase enzyme mix (GlOX/Cat ) | a gift from Jonas Ries | Hoess, Mund, Reitberger, & Ries, 2018 | 20x, 1916 U/mL glucose oxidase (Sigma G7141), 42350 U/mL catalase (Sigma C3155), 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 51% glycerol, MilliQ water. Stored at -20 °C. |
Imaging buffer base | a gift from Jonas Ries | Hoess, Mund, Reitberger, & Ries, 2018 | 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM NaCl, 10% D-Glucose. Aliquoted to a single-use volume (950 μL), frozen, and kept at -80 °C. |
Invitrogen ProLong Glass Antifade Mountant | ThermoFischer Scientific | P36982 | |
Leica Stellaris 8 STED FALCON | Leica | N/A | The microscope is equiped with the latest generation white light laser, a 775nm pulsed STED laser, the FALCON Fluorescence Lifetime IMaging module, HC PL APO CS2 100x/1.40 oil objective, and Leica HyD X detector. The system is capable of FLIM module enhanced Tau-STED which measures the specific fluorescence lifetime of a dye and is therefore capable of removing background signal based on differences in fluorescence lifetimes of the dyes, and dye conditions in the sample. Additionally, the resolution is increased by accounting for the variation of fluorescence lifetimes in different areas of the depletion donut. |
Longwave channel emission filter | AHF Analysentechnik | F47-702 | 700/100 nm bandpass |
Methanol (absolute for analysis) | Merck | 67-56-1 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich/Merck | S5761-500G | 100 mM NaHCO3, pH 8.3 |
Near-infrared fiber-coupled laser | Toptica | IBEAM-SMART-PT-CD | Custom Design, 808 nm – 75mW |
Objective lens piezo mount (PIFOC ) | Physik Instrumente | P-726.1.CD | 100 µm travel range |
Orca Fusion BT sCMOS camera | Hamamatsu | C15440-20UP | |
PCR tubes | Greiner Bio-One | 673283 | 0.2 mL |
Phosphate Saline Buffer (PBS 10x) | N/A | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4 | |
Pierce 16% formaldehyde (w/v), methanol free | ThermoFischer Scientific | 28906 | 16% formaldehyde is transferred from the original glass ampule into 1.5 mL tube and kept at room temperature. |
PlasmaPrep2 plasma cleaner | GaLa Instrumente GmbH | N/A | |
Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich/Merck | P2636-25MG | 0.1% w/v solution was prepared in Milli-Q water, and stored in aliquots at -20 °C. |
Primary dichroic (illumination reflecting) | AHF Analysentechnik | F73-866S | quad bandpass @ 405, 488, 561, 640 |
Quadnotch filter | AHF Analysentechnik | F40-072 | 405/488/561/640 nm |
Quadrant photodiode (QPD) | Laser Components | SD197-23-21-041, LC301DQD-PV | |
Razor blades | Apollo Herkenrath Solinger | N/A | |
Refractive beam shaper | AdlOptica | PiShaper 6_6_VIS | |
Roche Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | 10x solution was prepared according to recommendation. Frozen aliquots were stored at -20 °C. |
Scalpel blade (Feather brand #11, No. 3) | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1110911 | |
Scalpel removal box | Fisher scientific | 10002-50 | |
Secondary dichroic (emission reflecting) | AHF Analysentechnik | F38-785S | 750 nm longpass |
Shortpass filter | Semrock | BSP01-785R-25 | 750 nm |
Shortwave channel emission filter | AHF Analysentechnik | F37-677 | 676/37 nm bandpass |
Single molecule localization microscope | EMBL Imaging Centre | Diekmann et al., 2020 with modifications | The microscope provides widefield epi-illumination via a single-mode fiber-coupled laser engine, additional booster laser, and refractive beam shaper to provide a uniform illumination field (Stehr et al, 2019). Widefield images are captured on a sCMOS camera and appropriate relay optics for a system magnification of 61x and a pixel size of 106 nm. For ratiometric imaging of spectrally overlapping far-red dyes, an image splitter produces two spectrally distinct images on the camera (splitting dichroic: 665 nm long pass, shortwave channel emission filter: 676/37 nm bandpass, longwave emission filter: 700/100 nm bandpass. An additional 405/488/561/640 nm quadnotch filter and 750 nm shortpass filter are common to the two paths and provide additional laser blocking). A compound cylindrical lens provides the astigmatism required for 3D imaging. To maintain a fixed focus across acquisitions exceeding 2 hours in time (comprising 200 000 – 250 000 images), focus locking is achieved by total internal reflection of a near-infrared fiber-coupled laser from the coverslip and subsequent height sensitive detection on a quadrant photodiode (QPD). The QPD signal provided closed-loop control of the objective lens piezo mount. For access to this microscope, refer to https://www.embl.org/about/info/imaging-centre or contact ic-contact@embl.de |
Single-mode fiber-coupled multi-laser engine | Toptica | iCHROME MLE-LFA-HP | Provides widefield epi-illumination of 100 mW at 405, 488, 561, 640 nm |
Splitting dichroic | AHF Analysentechnik | F48-665SG | 665 nm long pass |
Square cover glass 22 x 22 mm No.1 | Menzel-Gläser; VWR | 630-2882 | |
STAR 635P, NHS ester | Abberior | ST635P-0002-1MG | Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 °C |
Stereo microscope Stemi 305 Stand K LAB | Zeiss | N/A | |
Tetramisole hydrochloride | Sigma-Aldrich/Merck | T1512-2G | 1% (w/v) solution was prepared in Milli-Q water. Frozen aliquots were stored at -20 °C. Thawed aliquot was kept at 4 °C and used for several months. |
TetraSpeck Microspheres | ThermoFischer Scientific | T7279 | 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red |
Tris Saline Buffer (TBS 10x) | N/A | 200 mM Tris-HCl, 1.5 M NaCl, pH 7.5 | |
TWEEN 20 | Sigma-Aldrich/Merck | P9416-50ML | Kept at room temperature in original packaging. |
WormStuff worm pick | Kisker | 789277 | |
XY microscope stage | Smaract | N/A | Custom Design |
Zeba Micro Spin Desalting Column | ThermoFischer Scientific | 89877 | 7K MWCO, 75 µL |