초고해상도 현미경은 감수 분열의 시냅톤 복합체 내 구성 요소 구성에 대한 자세한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 여기에서는 Caenorhabditis elegans synaptonemal 복합체의 개별 단백질을 해결하기위한 프로토콜을 보여줍니다.
감수 분열 동안, 상동 염색체는 올바른 분리를 허용하기 위해 서로를 인식하고 부착해야합니다. 상동 염색체의 상호 작용을 확보하는 주요 사건 중 하나는 감수 분열 전상 I에서 시냅톤 복합체 (SC)의 조립입니다. 다른 종들 사이에서 SC 내의 단백질 성분들 사이에 서열 상동성이 거의 없지만, SC의 일반적인 구조는 진화 동안 고도로 보존되어 왔다. 전자 현미경 사진에서 SC는 측면 요소 또는 축, 가로 필라멘트 및 중심 요소로 구성된 삼자 사다리 모양의 구조로 나타납니다.
그러나 SC의 분자 구조를 결정하기 위해 전자 현미경으로 복합체 내 개별 성분의 위치를 정확하게 식별하는 것은 여전히 어려운 일입니다. 대조적으로, 형광 현미경은 복합체 내의 개별 단백질 성분을 식별할 수 있게 해줍니다. 그러나 SC의 폭이 ~100nm에 불과하기 때문에 회절이 제한된 기존의 형광 현미경으로 하부 구조를 해결할 수 없습니다. 따라서 SC의 분자 구조를 결정하려면 구조화 조명 현미경(SIM), 유도 방출 고갈(STED) 현미경 또는 단일 분자 국소화 현미경(SMLM)과 같은 초고해상도 광학 현미경 기술이 필요합니다.
SC 내에서 개별 구성 요소의 구조와 상호 작용을 유지하려면 생식 세포의 고유 환경에 가까운 환경에서 복합체를 관찰하는 것이 중요합니다. 따라서 우리는 SMLM 및 STED 현미경으로 손상되지 않은 압출 Caenorhabditis elegans 생식선 조직에서 SC의 하부 구조를 연구할 수 있는 면역조직화학 및 이미징 프로토콜을 입증합니다. 조직을 커버슬립에 직접 고정하면 이미징 중 샘플의 움직임을 줄이고 샘플의 수차를 최소화하여 생물학적 맥락에서 SC의 하부 구조를 시각화하는 데 필요한 고해상도를 얻을 수 있습니다.
감수 분열 동안 염색체 수를 절반으로 줄이는 것은 성적으로 번식하는 유기체에서 건강한 자손을 생성하는 데 중요합니다. 염색체 수의 이러한 감소를 달성하기 위해, 상동 염색체는 감수 분열 I 동안 쌍을 이루고 분리되어야합니다. 상동 염색체의 정확한 분리를 보장하기 위해 생식 세포는 확장된 prophase I을 거치며, 이 기간 동안 상동 염색체가 쌍, 시냅스 및 재결합하여 상동체1 사이의 물리적 연결을 생성합니다. SC는 감수 분열2 단계를 통해 올바른 진행을 조절하는 핵심 구조로 부상했습니다.
SC는 단백질 구성 요소 사이에 상동성이 거의 없음에도 불구하고 일반적인 구조가 진화적으로 보존되는 복합체입니다. SC는 전자 현미경 사진에서 두 개의 측면 요소 또는 축, 가로 필라멘트로 형성된 중앙 영역 및 중심 요소 3,4로 구성된 삼자 사다리 모양의 구조로 처음 확인되었습니다. 복합체 내에서 개별 구성 요소의 구성을 결정하는 것은 감수 분열 단계에서 SC의 역할에 대한 이해를 높이는 데 중요합니다.
모델 유기체 C. elegans는 생식선이 완전히 조립된 SC5를 가진 많은 수의 감수 분열 핵을 포함하고 있기 때문에 SC의 구조와 기능을 연구하는 데 이상적입니다. 유전 및 생화학 적 연구에 따르면 염색체 축은 C. elegans에서 HTP-1 / 2 / 3 및 HIM-3 7,8,9,10,11이라고하는 3 개의 별개의 코헤신 복합체 6,7과 4 개의 HORMA 도메인 단백질에 의해 형성됩니다. SC의 중앙 영역에서, 코일 코일 도메인을 함유하는 6 개의 단백질이 현재까지 12,13,14,15,16,17로 확인되었다. 두 축 사이의 거리를 연결하기 위해 SYP-1, -5 및 -6은 일대일 방식으로 이량 체화되는 반면 (그림 1), 세 개의 추가 단백질은 중심 요소16,17,18,19에서 상호 작용을 안정화시킵니다.
이러한 단백질의 조직에 대한 자세한 통찰력을 얻는 것은 감수 분열 동안 SC의 많은 기능을 이해하는 데 필수적입니다. SC의 중심 영역의 폭이 ~ 100 nm에 불과하기 때문에 회절 제한 형광 현미경으로 하부 구조를 분해 할 수 없습니다. 그러나 이 크기의 구조 내에서 구성 요소를 시각화하는 것은 초고해상도 현미경으로 쉽게 달성할 수 있습니다. 실제로, 구조화 조명 현미경 (SIM), 확장 현미경 (20), 자극 방출 고갈 (STED) 현미경 (21) 및 단일 분자 국소화 현미경 (SMLM) 22,23은 종 16,24,25,26,27,28,29에 걸쳐 SC의 분자 구조를 연구하는 데 필수적인 도구로 부상했습니다. 30.
분해능 한계를 극복하기 위해 STED 현미경은 방출광의 회절 제한 스폿을 STED 레이저의 도넛 모양 빔과 오버레이하는 데 의존하며, 이는 이론적으로 점 확산 기능을 분자 치수31,32까지 제한합니다. 그러나, 생물학적 샘플 내에서 STED에 의해 실질적으로 달성 가능한 분해능은 xy33에서 수십 나노미터의 범위로 유지된다.
SMLM 기술로 생물학적 샘플에서 더 높은 분해능을 얻을 수 있습니다. SMLM은 특정 형광단의 깜박임 특성을 활용하여 공간적으로 겹치는 형광단을 시간에 분리하여 하위 회절 수준에서 물체를 해결합니다. 그런 다음 샘플을 반복적으로 이미지화하여 형광단의 다양한 하위 집합을 캡처합니다. 그런 다음 샘플 내 형광단의 위치는 모든 이미지에서 얻은 신호에 점 확산 함수(PSF)를 피팅하여 결정되며, 이는 15nm23,34까지 구조를 분해할 수 있습니다.
종합하면, 국부적 인 이미지는 모든 형광단의 위치를 인코딩합니다. SMLM의 분해능은 형광단의 표지 밀도 및 깜박임 특성에 의해 결정됩니다. Nyquist-Shannon 기준에 따르면 평균 레이블 간 거리의 두 배 미만인 물체를 안정적으로 해결하는 것은 불가능합니다. 따라서 고해상도 이미징을 위해서는 높은 라벨링 밀도가 필요합니다. C. elegans의 SC의 경우, 게놈 편집을 사용하여 내인성 단백질의 특정 부위에 부착 된 에피토프 태그를 사용하여 높은 표지 밀도를 달성 할 수 있습니다. 이어서, 에피토프 태그는 높은 친화도19,30을 갖는 특이적 모노클로날 항체를 사용하여 고밀도로 염색될 수 있다. 동시에, 개별 형광단의 온-사이클은 공간적으로 중첩되는 형광단이 동시에 포집되지 않도록 충분히 짧아야 한다(35).
이 두 가지 요구 사항으로 인해 SC와 같은 큰 거대분자 복합체의 구조를 해결하려면 충분히 많은 수의 이미지를 이미징해야 하므로 몇 시간이 걸릴 수 있습니다. 긴 이미징 시간의 함정은 샘플이 스테이지의 이동 또는 샘플 버퍼 내의 작은 전류로 인해 드리프트되는 경향이 있다는 것입니다. 10nm 정도의 작은 움직임도 nm 분해능에서는 해롭기 때문에 이를 수정해야 합니다. 그러나, 일반적으로 사용되는 드리프트 보정 방법들은 순차적으로 이미징된 2개의 채널의 이미지들을 정확하게 오버레이할 만큼 충분히 견고하지 않다(36). 생물학적 질문은 종종 동일한 샘플 내에서 여러 표적의 정확한 검출 및 위치를 요구하기 때문에 문제가됩니다. 이러한 문제를 피하기 위해 비율 측정 이미징과 같은 방법이 개발되었습니다. 비율계량 이미징은 중첩된 여기 및 방출 스펙트럼을 갖는 다수의 형광단의 동시 이미징을 허용하며, 스펙트럼적으로 구별되는 채널(37,38)에서의 강도의 비율에 기초하여 각각의 검출된 신호의 후속 할당을 각각의 형광단에 할당한다.
또한 SC와 같은 거대 분자 복합체의 조직을 연구하려면 3차원(3D) 정보가 필요합니다. 3차원(3D-SMLM)에서 초고해상도를 달성하기 위해 초점면으로부터의 거리에 따라 형광단의 PSF 모양을 왜곡하는 방출된 빛의 광학 경로에 원통형 렌즈가 통합되어 있습니다. 따라서, z-평면에서 형광단의 정확한 위치는 방출 신호(35, 39)의 형상을 분석함으로써 외삽될 수 있다. SMLM에서 이러한 발전을 결합하면 SC를 포함한 거대분자 복합체의 3D 조직을 이미징할 수 있습니다.
상동 염색체의 올바른 재조합 및 분리에 필수적인 SC의 사다리 모양의 조직은 거의 70 년 전에 전자 현미경 3,4에서 처음 관찰되었습니다. SC의 전체 조직은 전자 현미경에서 쉽게 해결되지만 이 복합체 내에서 개별 구성 요소의 국소화에는 보다 표적화된 접근 방식이 필요합니다. 폭이 ~100nm에 불과하기 때문에 SC의 하부 구조는 기존의 형광 현미경으로 분해할 수 없습니다. 그러나 초고해상도 현미경은 시냅톤 복합체 16,19,24,25,26,27,28,29,30의 구조와 기능에 대한 새로운 발견의 주요 동인이 되었습니다. 이 연구를 용이하게하기 위해 SMLM 및 STED 현미경으로 C. elegans 생식선 조직 내에서 SC의 구조를 연구 할 수있는 장착 절차를 시연했습니다.
SMLM 이미징에서 해상도를 최적화하는 중요한 단계는 생식계열 조직을 poly-L-라이신 코팅 커버슬립에 직접 가교하는 것입니다(4단계). 커버슬립에 조직을 공유 부착하는 것은 샘플 내에서 큰 드리프트를 초래하고 SMLM의 장기간에 걸친 이미징을 불가능하게 만드는 움직임을 줄이는 데 필수적입니다. 또한 커버슬립에서 멀리 떨어진 곳에 SC를 포함하는 핵을 떠나는 차선책의 부착물조차도 구면 수차로 인한 달성 가능한 해상도가 크게 떨어집니다(그림 4). 여기에 사용된 공유 부착에 대한 대안적으로, 염색된 생식계열 조직은 또한 이미징 완충액(19, 30)의 작은 방울에서 2개의 밀봉된 커버슬립 사이에 고정화될 수 있다. 그러나, 이러한 고정화 방법은 여기에서 최적화된 프로토콜에 사용된 1mL에서 단 몇 μL로 샘플 내의 이미징 버퍼의 부피를 심각하게 감소시키고, 이는 이미징 버퍼의 산성화를 초래하고 샘플이 이미징될 수 있는 시간을 심각하게 감소시킬 것이다(38,53,54).
SMLM 및 STED 현미경 검사의 획득 시간이 길기 때문에 화학적으로 고정된 샘플의 이미징에 이러한 방법을 사용하는 것이 제한됩니다. 여기서 파라포름알데히드 고정은 샘플 준비 및 이미징 중에 SC의 구조가 보존되도록 합니다. 그러나, 손상되지 않은 조직 내에서 SC를 이미지화하기 위해 여기에서 취해진 예방 조치에도 불구하고, 고정 후 SC의 결과 구조는 살아있는 유기체 내의 그의 본래 상태의 구조와 반드시 동일하지는 않다. 더욱이, 고정된 SC의 단일 이미지가 생물학적 구조의 단일 “스냅샷”을 나타내기 때문에, 이러한 접근법은 생체내에서 천연 구조의 역학에 대해 맹목적으로 남아 있다.
그러나 거대 분자 구조의 역학 및 가변성에 대한 정보는 단일 “스냅 샷”뿐만 아니라 많은 “스냅 샷”을 획득하여 얻을 수도 있습니다. 이러한 접근법이 파키텐19 동안 SC의 구조 변화를 해결할 수 있지만, 이 프로토콜을 사용하여 제조된 단일 샘플로부터 획득될 수 있는 이미지의 수를 제한하는 몇 가지 요인이 있다. 첫째, 이미지 획득 중에 사용되는 높은 레이저 출력은 형광단의 영구적인 표백으로 이어지고 인접한 관심 영역 또는 여러 z-평면의 이미징을 배제하여 단일 샘플에서 획득할 수 있는 이미지 수를 크게 줄입니다. 둘째, 이 방법으로 제조된 커버슬립의 샘플/조직 밀도가 낮아 단일 커버슬립에서 획득할 수 있는 이미지 수가 크게 제한됩니다. 낮은 샘플 밀도는 또한 다른 생물학적 질문 34,55,56,57,58,59를 밝히는 데 도움이 되는 자동화된 이미지 획득 파이프라인의 사용을 금지합니다. 그러나 샘플 밀도는 숙련 된 사용자가 약간 높일 수 있습니다.
여기에 제시된 프로토콜은 SMLM35에서 최적의 분해능을 달성하는 데 필요한 높은 라벨링 밀도를 얻도록 최적화되어 있습니다. 이전 프로토콜은 면역염색16 전에 조직을 커버슬립에 공유 결합한 반면, 이 새로운 프로토콜은 샘플을 용액으로 염색한 후에만 조직을 커버슬립에 가교합니다. 이러한 변형은 면역표지에 사용되는 항체가 모든 면에서 조직에 자유롭게 접근할 수 있도록 하는 반면, 커버슬립에 대한 조직의 공유 부착은 항체가 커버슬립에 가장 가까운 핵에 도달하는 것을 제한하여 표지의 정도를 감소시킬 수 있습니다. 여기에 설명된 수정 사항은 분해능을 40-50nm(FRC 분해능)16 에서 30-40nm(이 프로토콜)로 향상시킵니다.
중요한 것은 SMLM에는 높은 표지 밀도와 높은 항체 농도가 필수적이지만 더 낮은 항체 농도를 사용하여 더 나은 STED 현미경 이미지를 얻을 수 있음을 발견했습니다(3단계). 수십 나노미터의 분해능에서 관심 단백질을 표지하는 데 사용되는 분자의 크기가 점점 더 중요해지고 있습니다. 따라서 우리는 전장 항체의 절반 크기인 F(ab’)2 단편을 사용했습니다. 더 작은 신호 소스로 인한 국소 대조의 개선, 따라서 전장 2차 항체를 사용하는 것과 비교하여 이러한 변형에 의해 얻어진 분해능은 TauSTED에 의한 중앙 영역 내의 SYP-5의 2개의 C-말단의 분해능을 허용했으며, 이는 전장 항체를 사용하는 종래의 STED에 의해 분해되지 않았다(도 16 및 데이터는 나타내지 않음). 우리는 손상되지 않은 C. elegan의 생식계열에서 SC를 이미징하기 위한 이 최적화된 프로토콜이 감수 분열 동안 SC의 구조-기능 관계를 조사하는 것을 용이하게 할 것으로 기대합니다.
The authors have nothing to disclose.
SMLM 이미징을 위한 이미징 버퍼를 공유해 주신 Jonas Ries와 Ries 연구소에 감사드립니다. 또한 이 프로토콜에 사용된 C. elegans 균주에 대해 김유미와 닭-항-HTP-3 항체에 대해 Abby F. Dernburg에게 감사드립니다. Olympus iXplore SPIN SR 컨포칼 현미경 사용에 대한 지원을 해주신 EMBL 하이델베르크 고급 광학 현미경 시설의 Marko Lampe와 Stefan Terjung에게 감사드립니다. 이 연구는 European Molecular Biology Laboratory와 Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation – 452616889, SK)의 지원을 받았습니다. 우리는 베링거 잉겔하임 재단이 아낌없이 지원하는 유럽 분자 생물학 연구소(EMBL IC)의 이미징 센터에서 제공하는 액세스와 서비스를 인정합니다.
100x/1.5 oil objective | Olympus | UPLAPO100XOHR | UPLAPO100XOHR |
2-mercaptoethylamine (MEA) | Sigma-Aldrich | 30070-10G | Dissolved in MilliQ water to 5 M solution, pH 8.7 adjusted with HCl. Aliquoted to a single-use volume, frozen, and kept at -80 °C. |
Additional 640 nm booster laser | Toptica | IBEAM-SMART-640-S-HP | |
AlexaFluor 594, NHS ester | ThermoFischer Scientific | A37572 | Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 °C |
AlexaFluor 647, NHS ester | ThermoFischer Scientific | A37573 | Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 °C |
anti-HA | Thermo Fisher Scientific | 2-2.2.14 | Mouse monoclonal, 1:250 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy) |
anti-HTP-3 | a gift from Abby F. Dernburg | MacQueen et al., 2005 | Chicken polyclonal, 1:250 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy) |
Caenorhabditis elegans strain YKM349 | a gift from Yumi Kim | Hurlock et al., 2020 | syp-5(kim9[syp-5::HA]) I; meIs8[pie-1p::GFP::cosa-1, unc-119(+)] II |
CF6680, NHS ester | Biotium | 92139 | Dissolved in DMSO to 1mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 °C |
Circular cover glass 12 mm No. 1 | Menzel-Gläser; VWR | 631-0713 | |
Circular cover glass 24 mm No. 1.5 | Carl Roth | PK26.1 | |
Cylindrical lenses | Thorlabs | LJ1516RM-A, LK1002RM-A | |
Egg Buffer (10x) | Edgar 1995 | 250 mM HEPES, 1.18 M NaCl, 480 mM KCl, 20 mM EDTA, 5 mM EGTA, pH 7.4 | |
Ethanol (absolute for analysis) | Merck | 64-17-5 | |
F(ab’)2 fragment anti-chicken IgY | Jackson Immunoresearch | AB_2340347 | Donkey polyclonal, 1:100 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy) |
F(ab’)2 fragment anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | AB_2340761 | Donkey polyclonal, 1:100 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy) |
Fisherbrand Microscope slides T/F Ground 0.8-1.0 mm thick | Fisher scientific | 7107 | |
Gauge Worm Pick 30 diameter 0.254 mm – Iridium 10% | Kisker | 789265 | |
Glucose oxidase/Catalase enzyme mix (GlOX/Cat ) | a gift from Jonas Ries | Hoess, Mund, Reitberger, & Ries, 2018 | 20x, 1916 U/mL glucose oxidase (Sigma G7141), 42350 U/mL catalase (Sigma C3155), 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 51% glycerol, MilliQ water. Stored at -20 °C. |
Imaging buffer base | a gift from Jonas Ries | Hoess, Mund, Reitberger, & Ries, 2018 | 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM NaCl, 10% D-Glucose. Aliquoted to a single-use volume (950 μL), frozen, and kept at -80 °C. |
Invitrogen ProLong Glass Antifade Mountant | ThermoFischer Scientific | P36982 | |
Leica Stellaris 8 STED FALCON | Leica | N/A | The microscope is equiped with the latest generation white light laser, a 775nm pulsed STED laser, the FALCON Fluorescence Lifetime IMaging module, HC PL APO CS2 100x/1.40 oil objective, and Leica HyD X detector. The system is capable of FLIM module enhanced Tau-STED which measures the specific fluorescence lifetime of a dye and is therefore capable of removing background signal based on differences in fluorescence lifetimes of the dyes, and dye conditions in the sample. Additionally, the resolution is increased by accounting for the variation of fluorescence lifetimes in different areas of the depletion donut. |
Longwave channel emission filter | AHF Analysentechnik | F47-702 | 700/100 nm bandpass |
Methanol (absolute for analysis) | Merck | 67-56-1 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich/Merck | S5761-500G | 100 mM NaHCO3, pH 8.3 |
Near-infrared fiber-coupled laser | Toptica | IBEAM-SMART-PT-CD | Custom Design, 808 nm – 75mW |
Objective lens piezo mount (PIFOC ) | Physik Instrumente | P-726.1.CD | 100 µm travel range |
Orca Fusion BT sCMOS camera | Hamamatsu | C15440-20UP | |
PCR tubes | Greiner Bio-One | 673283 | 0.2 mL |
Phosphate Saline Buffer (PBS 10x) | N/A | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4 | |
Pierce 16% formaldehyde (w/v), methanol free | ThermoFischer Scientific | 28906 | 16% formaldehyde is transferred from the original glass ampule into 1.5 mL tube and kept at room temperature. |
PlasmaPrep2 plasma cleaner | GaLa Instrumente GmbH | N/A | |
Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich/Merck | P2636-25MG | 0.1% w/v solution was prepared in Milli-Q water, and stored in aliquots at -20 °C. |
Primary dichroic (illumination reflecting) | AHF Analysentechnik | F73-866S | quad bandpass @ 405, 488, 561, 640 |
Quadnotch filter | AHF Analysentechnik | F40-072 | 405/488/561/640 nm |
Quadrant photodiode (QPD) | Laser Components | SD197-23-21-041, LC301DQD-PV | |
Razor blades | Apollo Herkenrath Solinger | N/A | |
Refractive beam shaper | AdlOptica | PiShaper 6_6_VIS | |
Roche Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | 10x solution was prepared according to recommendation. Frozen aliquots were stored at -20 °C. |
Scalpel blade (Feather brand #11, No. 3) | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1110911 | |
Scalpel removal box | Fisher scientific | 10002-50 | |
Secondary dichroic (emission reflecting) | AHF Analysentechnik | F38-785S | 750 nm longpass |
Shortpass filter | Semrock | BSP01-785R-25 | 750 nm |
Shortwave channel emission filter | AHF Analysentechnik | F37-677 | 676/37 nm bandpass |
Single molecule localization microscope | EMBL Imaging Centre | Diekmann et al., 2020 with modifications | The microscope provides widefield epi-illumination via a single-mode fiber-coupled laser engine, additional booster laser, and refractive beam shaper to provide a uniform illumination field (Stehr et al, 2019). Widefield images are captured on a sCMOS camera and appropriate relay optics for a system magnification of 61x and a pixel size of 106 nm. For ratiometric imaging of spectrally overlapping far-red dyes, an image splitter produces two spectrally distinct images on the camera (splitting dichroic: 665 nm long pass, shortwave channel emission filter: 676/37 nm bandpass, longwave emission filter: 700/100 nm bandpass. An additional 405/488/561/640 nm quadnotch filter and 750 nm shortpass filter are common to the two paths and provide additional laser blocking). A compound cylindrical lens provides the astigmatism required for 3D imaging. To maintain a fixed focus across acquisitions exceeding 2 hours in time (comprising 200 000 – 250 000 images), focus locking is achieved by total internal reflection of a near-infrared fiber-coupled laser from the coverslip and subsequent height sensitive detection on a quadrant photodiode (QPD). The QPD signal provided closed-loop control of the objective lens piezo mount. For access to this microscope, refer to https://www.embl.org/about/info/imaging-centre or contact ic-contact@embl.de |
Single-mode fiber-coupled multi-laser engine | Toptica | iCHROME MLE-LFA-HP | Provides widefield epi-illumination of 100 mW at 405, 488, 561, 640 nm |
Splitting dichroic | AHF Analysentechnik | F48-665SG | 665 nm long pass |
Square cover glass 22 x 22 mm No.1 | Menzel-Gläser; VWR | 630-2882 | |
STAR 635P, NHS ester | Abberior | ST635P-0002-1MG | Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 °C |
Stereo microscope Stemi 305 Stand K LAB | Zeiss | N/A | |
Tetramisole hydrochloride | Sigma-Aldrich/Merck | T1512-2G | 1% (w/v) solution was prepared in Milli-Q water. Frozen aliquots were stored at -20 °C. Thawed aliquot was kept at 4 °C and used for several months. |
TetraSpeck Microspheres | ThermoFischer Scientific | T7279 | 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red |
Tris Saline Buffer (TBS 10x) | N/A | 200 mM Tris-HCl, 1.5 M NaCl, pH 7.5 | |
TWEEN 20 | Sigma-Aldrich/Merck | P9416-50ML | Kept at room temperature in original packaging. |
WormStuff worm pick | Kisker | 789277 | |
XY microscope stage | Smaract | N/A | Custom Design |
Zeba Micro Spin Desalting Column | ThermoFischer Scientific | 89877 | 7K MWCO, 75 µL |