Métodos In Ovo y Ex Ovo para estudiar el desarrollo del oído interno aviar

El oído interno de todos los vertebrados se deriva de un epitelio simple conocido como el placode ótico ^1,2. Esto dará lugar a todos los elementos estructurales y los tipos de células necesarios para transducir la información mecanosensorial asociada con la audición y la percepción del equilibrio. Las células ciliadas (HC), el sensor ciliado del oído interno, están rodeadas por células de soporte (SC). Los HC transmiten información al cerebro posterior auditivo a través de las neuronas del octavo nervio craneal. Estos también se generan a partir del placa ótica³. La transducción primaria del sonido se logra en la superficie apical de la HC auditiva, a través de un haz de cabello mecánicamente sensible⁴. Esto está mediado a través de protuberancias modificadas basadas en actina llamadas estereocilios, que están dispuestas en un patrón de escalera gradual⁵. Además, un cilio primario modificado, llamado kinocilium, organiza la formación del haz capilar y es adyacente a la fila más alta de estereocilios ^6,7,8. La arquitectura de los estereocilios es crítica para este papel en la conversión de estímulos mecánicos derivados de la energía acústica en señales neuronales eléctricas⁹. El daño a la HC auditiva por envejecimiento, infección, trauma otoacústico o shock ototóxico puede resultar en pérdida parcial o completa de la audición que, en los mamíferos, es irreversible¹⁰.

Se han propuesto terapias de reemplazo celular que podrían reparar ese daño^11,12. El enfoque de esta investigación ha sido comprender el desarrollo normal de las células ciliadas de mamíferos y preguntar si los programas de desarrollo pueden reiniciarse en células progenitoras que pueden existir dentro del oído interno¹³. Un segundo enfoque ha sido mirar fuera de los mamíferos, a vertebrados no mamíferos en los que se produce una regeneración robusta de las células ciliadas auditivas, como las aves^14,15. En las aves, la regeneración de las células ciliadas ocurre predominantemente a través de la desdiferenciación de una célula de soporte a un estado similar al progenitor, seguida de una división mitótica asimétrica para generar una célula ciliada y una célula de soporte¹⁶. Además, también se ha observado diferenciación directa de una célula de soporte para generar una célula ciliada¹⁷.

Si bien los mecanismos del desarrollo auditivo aviar muestran similitudes significativas con los de los mamíferos, existen diferencias¹⁸. La diferenciación de HC y SC en la PA del pollo es evidente desde el día embrionario (E) 7, volviéndose más clara con el tiempo. Para E12, se puede visualizar una papila basilar (PA) bien modelada y bien polarizada, y para E17 se pueden ver células ciliadas bien desarrolladas¹⁹. Estos puntos de tiempo proporcionan ventanas a los mecanismos de diferenciación, patrones y polaridad, así como a la maduración de las células ciliadas. Comprender si tales mecanismos se conservan o divergen es importante, ya que proporcionan información sobre la profunda homología de los orígenes de las células ciliadas mecanosensoriales.

Aquí, demostramos una serie de técnicas realizadas en etapas embrionarias tempranas y tardías para estudiar procesos celulares como la proliferación, la especificación del destino, la diferenciación, el patrón y el mantenimiento a lo largo del desarrollo del órgano del oído interno. Esto complementa otros protocolos para comprender el desarrollo del oído interno en el cultivo de explantes^20,21,22. Primero discutimos la introducción de ADN o ARN exógeno en precursores de PA dentro del otocisto E3.5 utilizando electroporación in ovo. Aunque las manipulaciones genéticas pueden proporcionar información valiosa, los fenotipos así generados pueden ser pleiotrópicos y, en consecuencia, confusos. Esto es particularmente cierto durante el desarrollo posterior del oído interno, donde los procesos fundamentales como la remodelación citoesquelética desempeñan múltiples funciones en la división celular, la morfogénesis tisular y la especialización celular. Presentamos protocolos de inhibición farmacológica en explantes cultivados, que ofrecen ventajas en el control de la dosis y el tiempo y duración del tratamiento, ofreciendo una manipulación espaciotemporal precisa de los mecanismos de desarrollo.

Se pueden utilizar diferentes métodos de cultivo de órganos dependiendo de la duración del tratamiento de los inhibidores pequeños. Aquí demostramos dos métodos de cultivo de órganos que permiten comprender la morfogénesis epitelial y la especialización celular. Un método para el cultivo 3D utilizando colágeno como matriz para cultivar el conducto coclear permite un cultivo robusto y una visualización en vivo de la PA en desarrollo. Para comprender la formación de estereocilios, presentamos un método de cultivo de membrana tal que el tejido epitelial se cultiva en una matriz rígida que permite que las protuberancias de actina crezcan libremente. Ambos métodos permiten el procesamiento posterior, como imágenes de células vivas, inmunohistoquímica, microscopía electrónica de barrido (SEM), registro celular, etc. Estas técnicas proporcionan una hoja de ruta para el uso efectivo del pollito como un sistema modelo para comprender y manipular el desarrollo, la maduración y la regeneración del epitelio auditivo aviar.