본 프로토콜은 내측 소인대를 절단하여 마우스 무릎을 불안정하게 한 후 관절 연골의 표면에 조절된 마이크로블레이드 스크래치를 기술한다. 이 동물 모델은 골괴사 형성, 골경화증 및 초기 단계 통증을 연구하기에 적합한 가속 형태의 골관절염(OA)을 제시합니다.
골관절염은 45세 이상의 사람들에게 가장 널리 퍼진 근골격계 질환으로 경제적, 사회적 비용이 증가합니다. 동물 모델은 질병의 여러 측면을 모방하는 데 사용됩니다. 본 프로토콜은 외상후 골관절염의 불안정화 및 연골 스크래치 모델(DCS)을 기술한다. 널리 사용되는 내측 반월판(DMM) 모델의 불안정화를 기반으로 DCS는 연골 표면에 세 가지 스크래치를 도입합니다. 현재 기사는 내측 반월판 인대를 횡단하여 무릎을 불안정하게 만드는 단계를 강조한 다음 관절 연골에 세 번의 의도적인 표면 긁힘을 나타냅니다. 동적 중량 지지, 미세 컴퓨터 단층 촬영 및 조직학에 의한 가능한 분석 방법도 시연됩니다. DCS 모델은 연골에 대한 골관절염의 영향에 초점을 맞춘 연구에는 권장되지 않지만, (1) 골괴사 형성, (2) 골관절염 및 부상 통증, (3) 전체 관절의 연골 손상 영향에 특히 중점을 두고 더 짧은 시간 내에 골관절염 발달을 연구할 수 있습니다.
골관절염(OA)은 45세 이상의 사람들에게 가장 널리 퍼진 근골격계 질환으로, 영국에서 875만 명 이상이 치료를 받고 있습니다1. 질병의 유병률 증가는 경제적 및 사회적 비용 증가로 이어졌고 장애의 주요 원인이며 환자의 삶의 질을 저하시킵니다1. 치료법이 없으면 질병의 발달과 진행을 이해하기 위한 연구를 가속화해야 할 시급한 필요성이 있습니다. 이 질병은 복잡하고 본질적으로 다 인성입니다. 이 질환의 주요 임상 측정은 통증 및 관절 이동성2이며, OA는 연골3뿐만 아니라 관절의 모든 조직에 영향을미칩니다. OA를 이해하는 데있어 주요 과제 중 하나는 초기 표현 / 부상에서 통증과 부동성을 동반 한 증상이있는 질병 진행에 이르기까지 수년, 때로는 수십 년이 걸릴 수 있다는 것입니다.
설치류에서 골관절염을 모델링하면 훨씬 더 짧은 시간 내에 시작과 진행을 이해하고 관련된 조직을 자세히 검사할 수 있으므로 OA 병태생리학에 대한 지식이 향상되었습니다. 유전자 변형 동물에서 외과 적 개입 모델에 이르기까지 골관절염의 수많은 쥐 모델이 있습니다. 외상 후 OA의 가장 널리 사용되는 쥐 모델은 내측 반월상 연골(DMM)의 불안정화입니다.4,5. 모델의 주의 사항은 서로 다른 연산자 간의 가변성입니다. 숙련 된 외과의는 관절 손상을 최소화하면서 절차를 수행 할 수 있지만 경험이없는 작업자는 관절낭을 장기간 노출시켜 연골에 손상을 입힐 수 있습니다. 프로세스의 이러한 가변성은 모델의 심각도에 영향을 미치며, 초기 손상이 많을수록 연골 손상 점수와 골괴사 형성이 증가합니다. 작업자 간의 가변성을 줄이고 임상 개입으로 인한 연골 손상을 모방하기 위해이 모델의 수정 된 버전이 개발되어 3 개의 표면 스크래치 형태로 연골 표면에 추가 손상이 가해집니다6. 이것은 또한 일부 임상 개입으로 인한 연골 손상으로 인한 OA 진행을 모델링 할 수있게합니다. 표준 DMM 모델과 비교하여 직접 유도된 연골 손상은 수컷 마우스에서 지속적으로 가속화된 돌출된 골괴사 형성, 연골 손상 및 염증 증가, 측정 가능한 대리 통증을 초래합니다.
이 모델은 골괴사 형성, 통증 표현 (수컷 마우스에서), 활막염 및 뼈 매개 변수의 초기 변화에 초점을 맞춘 초기 단계의 외상 후 OA 연구에 특히 적합합니다. 이 모델에서 골괴사 형성의 일관성은 골괴사 형성이 연골내 골화를 통한 복구 과정이기 때문에 뼈 복구 및 연골 내골화를 연구하는 것이 적절합니다7. 이 모델은 또한 관절 경 수술 절차와 같은 임상 개입 중에 연골에 직접 도입 된 손상을 모방하므로 전체 관절에 대한 연골 손상의 영향 연구에도 적합합니다.
외상 후 골관절염 (PTOA)의 외과 적 유도를 수행하려면 보조자의 지원이 강력히 권장됩니다 (예 : 수술자가 수술에 집중하는 동안 마우스를 준비). 이것은 무균 수술을 용이하게하여 감염의 위험을 줄이고 대규모 실험에서보다 효율적으로 개입 할 수 있습니다. 수술 중 초점면을 잃기 쉽기 때문에 초점을 맞추기 위한 페달이 포함된 현미경은 수술 내내 무균 상태를 유지하는 데 도움이 되는 중요한 기능입니다. 마우스와 무릎의 위치가 중요합니다. 무릎은 위쪽을 향하고 무릎 관절 공간의 개방을 최대화하기 위해 충분히 구부러져 있어야 하며, 과두 표면을 긁기 위해 마이크로블레이드를 도입하기 위해 인대에 더 쉽게 접근할 수 있습니다. MMTL을 식별하는 것은 특히 지방 패드가 평소보다 크거나 작은 출혈이있는 경우 어려울 수 있습니다. 출혈을 피하려면 지방 패드를 위로 밀어 눈물과 그에 따른 출혈을 방지하십시오. 지방 패드가 크면 시간이 조금 더 걸릴 수 있지만 참을성있게 계속 위로 밀어 올리십시오.
MMTL은 경골 과두에 매우 가깝기 때문에 MMTL 아래에 구부러진 스프링 가위의 하부 날을 배치 할 때 연골을 손상시키지 않도록주의해야합니다. 구부러진 블레이드는 내측을 향하고 과두와 평행하게 약간 위쪽을 가리켜야 합니다. MMTL을 가장 잘 절단하려면 가위가 날카로운지 확인하십시오. 인대를 자른 후 반월 상 연골이 내측으로 움직일 수 있는지 확인하십시오., 때로는 추가 절단이 필요한 작은 부착물이 남아 있기 때문입니다. 과두를 긁기 위해 마이크로 블레이드를 도입 할 때 과두에 수직이어야합니다. 첫 번째 스크래치를 관절의 중앙에 가깝게 만들되 전방 십자 인대가 손상되지 않도록주의하십시오. 그런 다음 내측으로 이동 한 다음 반월 상 연골 뒤로 이동하십시오. 긁힌 자국은 연골에 희미한 흰색 선으로 보일 수 있습니다. 우리는 일반적으로 클립을 사용하기 때문에 초기 절개는 측면에서 수행되므로 클립을 상처를 닫은 후 다리 측면에 위치합니다. 이렇게 하면 마우스가 다시 움직일 때 클립이 무릎을 문지르는 것을 방지할 수 있습니다. 봉합사를 사용할 때는 피하 바늘을 사용하는 것이 좋습니다. 외부 바늘을 사용하는 경우, 마우스는 바늘을 g아 먹고 상처를 열어 감염 가능성을 높입니다. 올바르게 수행되면 이 수술은 절개에서 상처 봉합까지 5-10분 이상 걸리지 않아야 하므로 연골의 노출과 발생할 수 있는 통제되지 않은 추가 손상을 최소화해야 합니다. 수술 후, 마우스는 매우 빨리 회복되고 거의 즉시 케이지로 올라가 정상적으로 움직일 수 있습니다. 마우스가 활동적이지 않으면 해당 장치의 적절한 전문가와상의해야합니다.
통증의 행동 평가를 위해 동적 체중 부하가 평가되었습니다. 그러나, 이 방법은 폰 프레이 검사(15)와 같은 다른 유발된 통증 검사보다 덜 민감한 것으로 간주될 수 있다. 통증을 모니터링하고 평가하기 위해 하나 이상의 방법을 사용하는 것이 좋습니다. DCS 개입 2주 후 관찰된 변화는 일시적이더라도 건강한 다리에 비해 일반적으로 OA 다리의 하중이 감소했음을 나타냅니다. 따라서, DCS 개입 2주 후를 사용하여 마우스 모델에서 초기 골관절염 또는 상해 통증을 평가할 수 있다. μCT에 의한 광물화된 골괴사의 시각화는 3차원 정량화를 가능하게 하며, 이는 조직학적 섹션12와도 일치할 수 있어 골괴사의 출현 및 진화 연구에 또 다른 차원을 추가합니다. 우리 그룹에서 골괴사의 존재는 DMM 모델에서 작업자 간 및 작업자 내에서 가변적이었습니다(2.3 ± 1 대 1.2 ± 1, n > 7, P = 0.0183), DCS의 유도는 작업자에 관계없이 모든 경우에 골괴사 생성을 강력하게 유도했습니다(2.6 ± 0.7 대 2.4 ± 0.5, n > 7, P = 0.711). 또한 DCS 모델에는 DMM에 비해 훨씬 더 크고 더 큰 골괴사가 있습니다. 따라서 DCS는 골괴사 형성 연구에 이상적인 모델입니다. 연골하 뼈의 로딩 영역으로 제한되는 골경화증의 정량화는 또한 작은 변화를 감지하는 개선입니다. 수술된 다리의 내측 구획을 반대쪽 다리와 비교하는 것은 또한 그 특정 마우스(12)의 내재적 골 표현형에 대해 정상화하는 방법을 제공한다. DCS 모델에서 연골 스크래치의 추가는 수술 동안 집중된 연골 손상을 유도하는 제어 된 수단이며 이는 질병의 많은 측면을 가속화합니다. 연골 자체에 대한 의도적 인 손상을 포함하는 실험 절차의 결과 중 하나는 연골 등급 시스템에서 이러한 인공적 손상을 배제하거나 조정해야한다는 것입니다. 이러한 제한 때문에 연구의 주요 목표가 연골 자체에 대한 골관절염의 영향을 이해하는 것이라면 이 모델을 권장하지 않습니다. 마지막으로, 적어도 두 명의 맹검 채점자가 연골 손상 및 활액막염 점수를 평가하는 것이 좋습니다. 이는 채점 시스템의 표준화를 검증하고 향상시킵니다.
이 연구의 한계는 DCS와 DMM 모델을 비교하는 모든 매개 변수의 변동성 정도가 완전히 평가되지 않았다는 것입니다. 이것은 앞으로 더 광범위한 연구를 통해 해결 될 것이며, 여기에는 다른 기관의 운영자 간의 변동성 평가도 포함될 수 있습니다.
결론적으로, 현재 DCS 모델에서 가속화된 OA 병인은 외상 후 OA의 표현을 허용하고 이 만성 쇠약 관절 질환을 유발하는 근본적인 OA 병태생리학적 메커니즘을 조사하고 해명할 수 있는 강력하고 강력한 연구 도구를 제공합니다. 또한 골형성, 골관절염 통증 및 연골 손상이 전체 관절에 미치는 영향에 초점을 맞춰 더 짧은 시간 내에 OA를 탐색할 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 이 출판물에 사용된 μCT 이미지를 획득한 리버풀 대학의 Gemma Charlesworth와 Mandie Prior의 연구를 인정하고 싶습니다. 작업은 Versus Arthritis (보조금 20199 및 22483)에서 자금을 지원했습니다. Lynette Dunning은 Versus Arthritis (보조금 20199)의 자금 지원을 받았습니다. Kendal McCulloch는 UWS PhD 장학금으로 자금을 지원 받았습니다. Carmen Huesa는 Versus Arthritis (보조금 20199 및 22483)의 자금 지원을 받았습니다.
#11 scalpel blade (and scalpel handle). | World precision instruments | 500240 | access the joint capsule |
15° Cutting Angle microsurgical stab knife | MSP | REF7503 | scratch the cartilage |
6-0 vicryl rapide | Any medical supplies provider | – | alternative method to close wound |
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Antibacterial skin clenser (Hibiscrub) | Amazon | – | To sterilise surgical skin area |
Applicator for 7 mm clips | World precision instruments | 500343 | close the wound |
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CT analyser | Bruker | 3D.SUITE software | Software |
Ctvol | Bruker | 3D.SUITE software | Software |
Data viewer | Bruker | 3D.SUITE software | Software |
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EDTA | Merck | E9884 | 10% solution in PBS (or water) to decalcify bone pH 7.4 |
Ethanol | Generic (many different suppliers) | – | for embedding decalcified bones |
Fast Green FCF | Merck | F7252 | For staining sections |
Glacial acetic acid | Merck | 1005706 | For stianing sections |
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Hoskins #21 micro-tweezers. | Cameron surgical limited | PHF1085 | move the fat pad |
Isofluorane | Supplied by unit as it is a prescription drug | – | |
Mice | Charles river | – | C57Bl6/J male 8 weeks old (to allow acclimatisation in the unit) |
Microcomputed tomography scanner | Bruker | SKYSCAN 1272 CMOS | µCT |
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Paraffin wax | Generic (many different suppliers) | – | for embedding decalcified bones |
Reflex 7 mm stainless steel wound clips or | Fine science tools | 12032-07 | close the wound |
Remover for 7 mm clips | World precision instruments | 500347 | remove wound clips |
Rotary Microtome | Generic (many different suppliers) | – | To cut section of Paraffin embedded tissue. |
Safranin-O | Merck | S2255 | For staining sections |
Serrated curved forceps | Fine science tools | 15915 | hold the skin |
Sterile Drape | Generic (many different suppliers) | – | To ensure sterility of surgical area |
Sterile Drape with key hole | Generic (many different suppliers) | – | To cover mouse and expose leg |
Sterile saline | Generic (many different suppliers) | ||
Sterile surgical drape | Generic (many different suppliers) | – | maintain sterile environment for surgical tools |
Sterile surgical drape with key hole | Generic (many different suppliers) | – | cover the mouse and keep leg through key hole |
Straight Scissors | World precision instruments | 14393 | open the wound |
Surgical microscope. | Generic (many different suppliers) | – | Adjustable focus. |
Vannas spring scissors with 2 mm blades. | Fine science tools | 15000-04 | cut the MMTL |
Xylene | Generic (many different suppliers) | – | for embedding decalcified bones |