用于评估COVID-19相关中耳病变的高速人颞骨切片
Özet
本文介绍了一种用于快速人颞骨切片的技术，该技术利用带有双金刚石锯片的微锯生成薄片，用于快速脱钙和分析颞骨免疫组织化学。
Abstract
人颞骨切片的组织病理学分析是研究内耳和中耳病理学的基本技术。颞骨切片通过死后颞骨采集、固定、脱钙、包埋和染色制备。由于颞骨的密度，脱钙是一个耗时且资源密集型的过程;完整的组织准备平均可能需要9-10个月。这减缓了耳病理学研究，阻碍了时间敏感的研究，例如与COVID-19大流行相关的研究。本文描述了一种快速制备和脱钙颞骨切片以加速组织处理的技术。
使用标准技术在死后收获颞骨，并固定在10%福尔马林中。使用带有双金刚石锯片的精密微锯将每个部分切割成三个厚的部分。然后将厚颞骨切片在脱钙溶液中脱钙7-10天，然后嵌入石蜡中，使用冷冻组切片成薄（10μm）切片，并安装在未充电的载玻片上。然后将组织样本脱蜡并重新水合以进行抗体染色（ACE2，TMPRSS2，呋喃蛋白）并成像。该技术将从收获到组织分析的时间从9-10个月缩短到10-14天。高速颞骨切片可能会提高耳病理学研究的速度，减少组织制备所需的资源，同时还可以促进时间敏感的研究，例如与COVID-19相关的研究。
Introduction
人类颞骨研究为研究内耳和中耳的病理学和病理生理学提供了宝贵的资源。在19世纪之前，人们对耳科疾病1，2，3知之甚少。为了更好地了解耳科疾病和“从庸医手中抢救出耳外科手术”，约瑟夫·汤因比（1815-1866）开发了研究人类颞骨组织学切片的方法3。在19世纪余下的时间里，维也纳的亚当·波利策（Adam Politzer，1835-1920）和欧洲各地的其他人进一步推动了这项工作，他使用颞骨切片来描述影响耳朵的许多常见疾病的组织病理学2，3，4。
美国第一个人类颞骨实验室于1927年在约翰霍普金斯医院开业，Stacy Guild（1890-1966）在那里开发了颞骨切片方法5，6。Guild开发的方法包括9-10个月的过程，包括死后收获，固定，硝酸脱钙，乙醇脱水，细胞样蛋白包埋，切片，染色和安装。哈罗德·舒克内希特（1917-1996）后来对这种技术进行了修改7;然而，这一过程的基本组成部分基本上没有改变。
维持颞骨实验室所需的大量资源对颞骨研究提出了挑战，并可能导致其在过去30年中受欢迎程度的下降4，8。颞骨实验室资源的很大一部分必须用于9-10个月的颞骨制备过程。准备过程中最耗时的步骤之一是颞骨的脱钙，颞骨是人体中最密集的骨头。脱钙通常在硝酸或乙二胺四乙酸（EDTA）中进行，需要数周至数月，同时需要频繁更换溶液7，9。此外，对人耳进行时间敏感的研究，例如与COVID-19大流行相关的研究，可能会受到这种缓慢的准备过程的阻碍。本文介绍了一种高速颞骨切片技术，该技术使用金刚石显微镜锯生成厚切片，从而可以在颞骨收获后10-14天内进行快速脱钙和组织分析。
Protocol
Representative Results
Discussion
人类颞骨研究对于研究内耳和中耳病理学至关重要，但仍然是一项时间和资源密集型工作。本文介绍了一种使用金刚石显微镜锯生成厚颞骨切片的技术，这些切片可以在进一步切片之前快速脱钙，从而将从组织收获到研究的时间从9-10个月减少到10-14天。该技术可以减少颞骨处理所需的资源，并促进时间敏感型研究，例如与COVID-19中耳和内耳病理学13相关的研究，这是开发该协议的…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢穆罕默德·莱哈尔对这个项目的协助。这项工作得到了美国国立卫生研究院（T32DC000027，NSA）的部分支持。
Materials
| Anti-ACE-2 Antibody (1:50 applied dilution) | Novus Biologicals | SN0754 | |
| Anti-Furin Antibody (1:250 dilution) | Abcam | EPR 14674 | |
| Anti-TMPRSS2 Antibody (1:1,000 dilution) | Novus Biologicals | NBP1-20984 | |
| BX43 Manual System Microscope | Olympus Life Science Solutions | ||
| CBN/Diamond Hybrid Wafering Blade | Pace Technologies | WB-007GP | |
| Collin Mallet – 8'' | Surgical Mart | SM1517 | |
| DS-Fi3 Microscope Camera | Nikon | ||
| Dual Endogenous Enzyme Block (commercial blocking solution) | Dako | S2003 | |
| Eaosin Stain | Sigma-Aldrich | 548-24-3 | |
| Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Formical-4 Decalcifier (formic acid decalcifying solution) | StatLab | 1214-1 GAL | |
| Hematoxylin Stain | Sigma-Aldrich | H9627 | |
| HRP-Conjugated Anti-Rabbit Secondary Antibody (1:100 dilution) | Leica Biosystems | PV6119 | |
| ImmPRESS HRP Horse Anti-Goat igG Detection Kit, Peroxidase (1:100 dilution) | Vector Laboratories | MP-7405 | |
| Lambotte Osteotome | Surgical Mart | SM1553 | |
| Metallographic PICO 155P Precision Saw | Pace Technologies | PICO 155P | microsaw |
| NIS Elements Software Version 4.6 | Nikon | ||
| Paraplast Plus | Sigma-Aldrich | P3683 | paraffin |
| Positive Charged Microscope Slides with White Frosted End | Walter Products | 1140B15 | |
| Thermo Shandon Crytome FSE Cryostat Microtome | New Life Scientific Inc. | A78900104 | cryotome |
| Triology Pretreatment Solution (commercial pretreatment solution) | Sigma-Aldrich | 920P-05 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 920P-05 |
Referanslar
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