本协议描述了 离体 降钙素基因相关肽(CGRP)释放模型以及量化药理学药物对啮齿动物三叉神经血管系统释放的CGRP量的影响的策略。
降钙素基因相关肽(CGRP)于1980年代首次被发现,是降钙素基因的剪接变体。自发现以来,它在偏头痛病理生理学中的作用已经得到充分确立,首先是其有效的血管扩张剂特性,随后是其在感觉三叉神经血管系统中作为神经递质的存在和功能。CGRP的偏头痛诱发能力支持制药行业开发抑制CGRP作用的单克隆抗体和拮抗剂。一种新的治疗模式已被证明在偏头痛的预防性治疗中是有效的。进一步了解偏头痛机制的有用工具之一是三叉神经血管系统释放CGRP的 离体 模型。这是一种相对简单的方法,可以与各种药理学工具一起使用,以获得进一步开发新的有效偏头痛治疗方法的专业知识。本协议描述了CGRP释放模型和量化药理学试剂对啮齿动物三叉神经血管系统释放量的CGRP影响的技术。提供了描述从安乐死到蛋白质水平测量的实验方法的程序。详细描述了小鼠和大鼠三叉神经节和三叉神经核尾核的基本分离以及大鼠硬脑膜的制备。此外,还介绍了两个物种(大鼠和小鼠)的代表性结果。该技术是利用各种药理化合物和转基因动物研究偏头痛病理生理学中涉及的分子机制的关键工具。
偏头痛是一种神经系统疾病,据世卫组织称,估计影响10亿多人,是全世界残疾的主要原因之一1。因此,偏头痛对患者和社会都有重大影响。尽管CGRP拮抗药物最近取得了临床成功,但很大一部分患者需要改进治疗方案2,3,4,5。需要阐明偏头痛病理生理学,从而找到新的有效治疗方法。由脑膜、三叉神经节 (TG) 和尾部三叉神经核 (TNC) 组成的三叉神经血管系统内的信号传导是偏头痛病理生理学的核心6,7。
37 个氨基酸的神经肽降钙素基因相关肽 (CGRP) 于 1980 年代初首次被发现,当时 Amara 及其同事证明,降钙素基因的主要 RNA 转录本可以被加工以提供除降钙素8,9 之外的 CGRP 的 mRNA 编码。随后的研究表明与偏头痛病理生理学有关10。CGRP是一种具有强效血管舒张特性的神经递质11,12,13,14,15,16,17,广泛分布于中枢和周围神经系统13,14,18,19,20,21,22.在人类偏头痛发作期间,发现脑外循环中的CGRP水平升高23,并且输注CGRP会导致患者偏头痛样疼痛24,从而强调了CGRP在偏头痛中的参与。两年后,关于CGRP拮抗剂olcegepant治疗偏头痛有效性的首次概念验证研究发表25。
CGRP在三叉神经血管系统中含量丰富,如TG21,26、支配硬脑膜的感觉神经纤维27,28,29和TNC30所示。在三叉神经血管系统中,CGRP存在于TG的中小型神经元中,在无髓鞘的C纤维中,并且在TG的近50%的神经元群中表达。CGRP受体主要在较大的神经元中表达,并在髓鞘化的Aδ纤维31,32中发现。CGRP在化学或电刺激下从神经元释放33,34。研究导致CGRP释放的途径和这种激活的位置对于理解偏头痛病理生理学至关重要。在过去的50年中,临床前研究有助于获得有关偏头痛相关信号的广泛知识,并有助于开发新的治疗方法35。许多考虑血管和神经源性受累的方法已被修改并应用于偏头痛研究。可以提及动脉对生物化合物或药物治疗的反应的体内和体外模型17,36,37和电神经刺激38,39。此外,TNC中激活的神经元可以通过c-Fos表达40,41,42和该区域的电生理记录43,44来检测。这两种方法都测量从头部传递到大脑的伤害性信号,例如硬脑膜。仅使用一种临床前模型并不能呈现偏头痛病理生理学的全貌。因此,结合涵盖偏头痛病理生理学尽可能多的方面的不同模型非常重要。新模型的持续开发将涵盖偏头痛机制的各个方面,并及时揭开偏头痛病理生理学的奥秘。
在这里,介绍了CGRP释放方法的详细方案,该方法在化学刺激后从小鼠中分离出TG和TNC离 体进行 。CGRP释放也可以在大鼠的硬脑膜中研究。因此,在大鼠的实验方案中,硬脑膜与TG和TNC一起描述。CGRP释放方法的基础于1999年首次描述,Ebersberger及其同事进行了开创性研究,发现CGRP在化学和电刺激大鼠45的硬脑膜传入后从硬脑膜中释放出来。后来,这种方法扩展到TG46 和TNC47的CGRP版本。随后,对该方法进行修改以应用于小鼠的TG和TNC。到目前为止,从硬脑膜释放CGRP在小鼠中一直具有挑战性。
所描述的方法是在研究表明CGRP在偏头痛病理生理学中的重要性之后开发的。它非常适合研究三叉神经血管系统释放CGRP的机制,这对于头部区域的疼痛信号传导至关重要。在该模型中获得的CGRP量直接测量支配硬脑膜,TG和TNC的三叉神经释放的CGRP量。CGRP的释放量定量大于人类热凝后血浆中测得的释放量45,54,猫39,55,56和偏头痛发作期间23。一种解释可能是CGRP在血液中被稀释和降解54。然而,需要注意的是,用化学物质直接刺激可能优于病理生理激活。进一步的优点是,可以从三叉神经血管系统内的三个不同部位定位释放,并且可以与药理学操作和转基因啮齿动物的组织一起使用。
最近,许多临床前啮齿动物模型专注于全身施用物质和随后的疼痛或偏头痛相关读数,使用von Frey测试57,58,鬼脸59,60,61或光厌恶62,63,64。这些方法有助于了解不同物质的疼痛诱导和缓解疼痛的特性。然而,这些方法没有提供关于所涉及的特定靶组织的信息。在本方法中,三叉神经血管系统分为三种结构:硬脑膜,TG和TNC。这样可以对每个结构进行局部暴露,并评估特定物质的作用位置。这在2011年的一项研究中得到了利用,其中探索了电压门控钙通道在大鼠中的作用,发现这些通道的抑制在三叉神经血管通路的三种结构中是不同的47。在解剖神经系统结构时,轴切开术是不可避免的。轴切开术已被证明可以改变各种基因的转录65。这些转录变化太慢,无法影响该方法的结果,但与体内情况相比,不能排除磷酸化的变化46。虽然CGRP等神经肽在细胞体中形成,但神经肽的释放和作用通常在中枢或周围神经末梢。因此,在研究神经肽释放时,对完整神经元(包括末端)的研究很有趣。因此,已经建立了研究来自孤立神经节的神经元培养物的方法,以作为终端的模型。然而,神经元细胞培养物存在几个问题,因为机械解离会破坏培养物中的神经元46。与细胞培养相关的较长时间框架使该方法对由于轴切开术和培养条件引起的转录组变化敏感65。此外,生长因子的添加和表面涂层上的培养改变了神经元作为递质和受体表达66,67,68,69的性质。在研究新鲜分离的完整神经节而不是神经元细胞培养物时,可以避免这些问题。
离体CGRP释放方法的一个挑战是精确解剖可重复结果所需的组织。特别准确地解剖TNC具有挑战性,因为这是脑干内没有可见边界的结构。此外,硬脑膜很脆弱,需要仔细去除大脑以确保结构完整。这些障碍可导致不同的组织大小,从而改变基础和刺激诱导的CGRP水平。然而,这种变化可以通过归一化到基础CGRP释放来解释。还应该注意的是,当从小鼠中分离TNC时,脑干的整个下部被分离出来,而不是像在大鼠中那样更具体的含TNC的部分。一般来说,使用大鼠组织可能是一个优势,因为这允许测量硬脑膜释放的CGRP和更精确地解剖TNC。此外,组织的大小也允许使用大鼠作为其载体对照,因为一只大鼠产生两个半颅骨,两个TG和两个TNC,其中一块组织用于物质刺激,另一块用于载体。当使用小鼠时,一个实验需要两只动物,因为两个TG都汇集在一个样品中,并且TNCs被解剖为一个脑干。因此,两个TG和一个脑干用于物质刺激,两个TG和一个来自另一只小鼠的脑干用于载体控制。这导致使用两倍于大鼠的小鼠来获得相同数量的重复。为了减少使用的小鼠数量,已经提出了一种测量脑干切片中CGRP释放的方法49。一个优点是该方法已被修改以能够使用小鼠。这允许使用许多已经可用的转基因小鼠品系,这是研究信号通路等的有用工具。实验结束时应包括阳性对照,以确保实验中使用的组织可以释放CGRP。阳性对照可能是TRPV1激动剂辣椒素或去极化刺激钾(KCl),已发现它们在小鼠和大鼠46,47,48,49,50中从三叉神经血管系统中释放CGRP。此外,该方法还适用于测量其他相关肽作为垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)的释放 – 偏头痛研究中非常感兴趣的另一种肽70。
该方法为研究大鼠和小鼠特定靶组织中CGRP的释放提供了有用的工具。这是一种相对快速的方法,可以避免与培养神经元相关的问题。该方法方案可以很容易地修改,以研究浓度-反应关系或各种药理化合物对反应的抑制。 离体 CGRP释放法是几种临床前方法之一,可用于研究CGRP的作用以及与CGRP释放相关的其他机制在偏头痛病理生理学中的作用。
The authors have nothing to disclose.
这项工作由Candys基金会资助。
6-well culture plate | NUNC | 140675 | |
Calcium chloride dihydrate | Merck | 1.02382.1000 | For SIF buffer |
Caps for plastic containers | ThermoFisher Scientific | 536617 | |
Capsaicin | Merck | M2028 | |
CGRP kits | AH Diagnostics | A05482.96 | |
CO2 | Strandmøllen | 4.6 | For carbogen gassing of SIF |
Delicate Bone Trimmer | Fine Science Tools | 16109-14 | |
Glibenclamide | Tocris | 911 | |
Glucose | Merck | G7021 | For SIF buffer |
Guillotine for rats | Scandidact | NS-802 | |
Magnesium sulfate heptahydrate | Merck | M5921 | For SIF buffer |
Microcenrifuge tubes + lids/caps | VWR | 700-5239 | |
Mini Hacksaw | BAHCO | 208 | |
O2 | Strandmøllen | 4.5 | For carbogen gassing of SIF |
Pentobarbital | Glostrup pharmacy | NA | Magistral formula |
Plastic containers | ThermoFisher Scientific | 536455 | |
Plate photometer – Infinite M200 | Tecan | NA | Infinite M200 is discontinued. A Infinite 200 PRO is available at Tecan. Software: SW Magellan v.6.3 |
Potassium chloride | Merck | P9333 | For SIF buffer |
Scissor | Allgaier Instruments | 307-156-170 | |
Small scissor | Allgaier Instruments | 04-520-115 | |
Sodium bicarbonate | Merck | S6014 | For SIF buffer |
Sodium chloride | Merck | S9888 | For SIF buffer |
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Merck | 1.06346.1000 | For SIF buffer |
Sodium gluconate | Merck | S2054 | For SIF buffer |
Spatula | Bochem Lab Supply | 3018 | |
Spring scissor | Fine Science Tools | 15024-10 | |
Sucrose | Merck | 84097 | For SIF buffer |
Supercinnamaldehyde | Merck | S3322 | |
Tulle (fabrics) | NA | NA | Bought in the local fabrics store |