Experimentelle Methoden zur Gewinnung adulter Stammzellen aus dem Darm- und Lebergewebe von Hunden zur Etablierung von 3D-Organoidkulturen werden beschrieben. Darüber hinaus werden die Labortechniken diskutiert, um ein konsistentes Wachstum zu gewährleisten und Standardarbeitsanweisungen für die Ernte, Biobank und Wiederbelebung von Darm- und Leberorganoidkulturen bei Hunden bereitzustellen.
Hunde entwickeln komplexe multifaktorielle Krankheiten analog zum Menschen, einschließlich entzündlicher Erkrankungen, Stoffwechselerkrankungen und Krebs. Daher stellen sie relevante Großtiermodelle mit dem translationalen Potenzial für die Humanmedizin dar. Organoide sind 3-dimensionale (3D), selbstzusammengesetzte Strukturen, die aus Stammzellen gewonnen werden und die Mikroanatomie und Physiologie ihres Ursprungsorgans nachahmen. Diese translationalen In-vitro-Modelle können für Anwendungen der Arzneimittelpermeabilität und -entdeckung, zur toxikologischen Bewertung und zur Bereitstellung eines mechanistischen Verständnisses der Pathophysiologie multifaktorieller chronischer Erkrankungen verwendet werden. Darüber hinaus können Hundeorganoide das Leben von Begleithunden verbessern, indem sie Input in verschiedenen Bereichen der veterinärmedizinischen Forschung liefern und personalisierte Behandlungsanwendungen in der Veterinärmedizin erleichtern. Eine kleine Gruppe von Spendern kann eine Biobank von Organoidproben erstellen, wodurch die Notwendigkeit einer kontinuierlichen Gewebeentnahme reduziert wird, da Organoidzelllinien unbegrenzt subkultiviert werden können. Hierin werden drei Protokolle vorgestellt, die sich auf die Kultur von Darm- und Leberkrebs-Organoiden aus adulten Stammzellen konzentrieren. Das Canine Organoid Isolation Protocol beschreibt Methoden zur Verarbeitung von Gewebe und zur Einbettung des Zellisolats in eine unterstützende Matrix (solubilisierte extrazelluläre Membranmatrix). Das Canine Organoid Maintenance Protocol beschreibt das Wachstum und die Wartung von Organoiden, einschließlich Reinigung und Passieren zusammen mit einem geeigneten Zeitpunkt für die Expansion. Das Organoid Harvesting and Biobanking Protocol beschreibt Möglichkeiten, Organoide für weitere Analysen zu extrahieren, einzufrieren und zu konservieren.
Nagetiere sind das am häufigsten verwendete Tiermodell für die biomedizinische und translationale Forschung1. Sie sind außerordentlich nützlich für die Untersuchung der grundlegenden molekularen Pathogenese der Krankheiten, obwohl ihre klinische Relevanz für chronische multifaktorielle Erkrankungen kürzlich in Frage gestellt wurde2. Das Hundemodell weist im Vergleich zu Nagetieren mehrere Vorteile auf3,4. Hunde und Menschen teilen Ähnlichkeiten in der Metabolomik und im Darmmikrobiom, die sich aufgrund des Verzehrs der menschlichen Ernährung während verschiedener Perioden ihrer Domestizierung entwickelt haben5,6,7. Ähnlichkeiten zwischen der Anatomie und Physiologie des Hundes und des menschlichen Magen-Darm-Trakts sind ein weiteres Beispiel8.
Darüber hinaus teilen Hunde oft ähnliche Umgebungen und Lebensstile mit ihren Besitzern9. Die längere Lebensdauer von Hunden im Vergleich zu Nagetieren ermöglicht die natürliche Entwicklung zahlreicher chronischer Erkrankungen10. Entzündliche Darmerkrankungen oder metabolisches Syndrom sind Beispiele für multifaktorielle chronische Erkrankungen, die wichtige Ähnlichkeiten zwischen Mensch und Hund aufweisen11,12. Präklinische Studien von Hunden, an denen Hunde mit natürlich vorkommenden Krankheiten beteiligt sind, können zuverlässigere Daten generieren als solche, die aus Nagetiermodellen gewonnen wurden13. Um jedoch den Einsatz von Lebendtierversuchen zu minimieren und den Prinzipien der 3R (Reduce, Refine, Replace)14 zu entsprechen, haben sich Alternativen zu In-vivo-Tests mit 3D-In-vitro-Organoiden für Hunde ergeben15.
Organoide sind selbstorganisierte 3D-Stammzellstrukturen, die die Physiologie und Mikroanatomie ihrer ursprünglichen Organe rekapitulieren16,17. Diese Technologie wurde erstmals 200917 von Sato et al. beschrieben und ermöglichte mehr übersetzbare In-vitro-Studien in Epithelzelllinien als bisher mit 2D-Krebszellkulturen18,19,20. Organoide sind in vitro-Modellen in vielen biomedizinischen Disziplinen nützlich, z. B. in präklinischen toxikologischen21,22,23-, Absorptions- oder Metabolismusstudien24,25,26,27,28 sowie videodan personalisierten medizinischen Ansätzen29,30,31 . Die erfolgreiche Kultur der Darmorganoide von Hunden wurde erstmals 201912 beschrieben, während Leberorganoide, die von einem Hund stammen, erstmals 201532 von Nantasanti et al. berichtet wurden. Canine Organoide wurden seitdem erfolgreich in Studien zur Untersuchung von chronischen Enteropathien bei Hunden, gastrointestinalen Stromatumoren, kolorektalen Adenokarzinomen12 und Morbus Wilson33,34 eingesetzt.
Während adulte Stammzellen über Nekropsien geerntet werden können, erfordert die Organoidtechnologie nicht immer die Opferung der Tiere. Endoskopische und laparoskopische Biopsien oder sogar Feinnadelaspirate von Organen35 sind eine lebensfähige Quelle für adulte Stammzellen zur epithelialen Organoidisolierung12. Der weit verbreitete Einsatz solcher nicht-invasiven Techniken in der tierärztlichen Praxis erleichtert Optionen für die reverse translationale Forschung (Übersetzung von Informationen aus der veterinärmedizinischen klinischen Praxis in die klinische Praxis am Menschen und umgekehrt)15. Die Weiterentwicklung der Organoidtechnologie kann durch die Standardisierung der Organoidkultur und der Wartungsmethoden sichergestellt werden. Das hier vorgestellte Organoidprotokoll basiert teilweise auf zuvor veröffentlichten Arbeiten von Saxena et al. aus dem Jahr 201536, und die Methoden wurden an die Besonderheiten der intestinalen und hepatischen Organoidkultur von Hunden angepasst. Der Gesamtablauf der Organoidprotokolle für Hunde ist in Abbildung 1 dargestellt.
Das Canine Organoid Isolation Protocol führt Methoden zur Gewinnung von Proben aus endoskopischen, laparoskopischen und chirurgischen Biopsien sowie Nekropsien ein. Es skizziert die anfängliche Vorbehandlung von Gewebeproben und Methoden für den Transport zum Labor. Materialien und Reagenzien, die für die Organoidisolierung benötigt werden, sind im Abschnitt “Vorbereitung zur Isolierung” zusammengefasst. Der Prozess der adulten Stammzellisolierung aus Gewebeproben wird ausführlicher beschrieben. Schließlich wird der Prozess der Beschichtung von Organoiden in kuppelartige Strukturen unter Verwendung einer solubilisierten extrazellulären Membranmatrix diskutiert.
Das zweite Protokoll, Canine Organoid Maintenance Protocol, beschreibt Methoden zur Dokumentation und Kultivierung von Organoiden. Medienwechsel und deren Häufigkeit werden in diesem Abschnitt behandelt. Weiterhin werden die Laborverfahren wie das Passieren und Reinigen der Zellkulturen beschrieben, die für die erfolgreiche Aufrechterhaltung von 3D-Canin-Organoiden unerlässlich sind. Die angemessene Weitergabe ist ein kritischer Schritt des Protokolls, und mögliche Anpassungen und Fehlerbehebungen dieses Schritts werden im Manuskript weiter diskutiert.
Das letzte Protokoll ist das Canine Organoid Harvesting and Biobanking Protocol, das Methoden zur Herstellung ausgewachsener Organoide für die Paraffineinbettung und RNA-Konservierung enthält. Auch Verfahren des Biobankings von Organoidproben in der Lagerung von flüssigem Stickstoff werden hier beschrieben. Schließlich werden die Möglichkeiten diskutiert, gefrorene Proben aufzutauen und ihr Wachstum zu unterstützen.
Zusammenfassend zielt dieser Artikel darauf ab, konsistente Organoidkulturverfahren für Hunde durch die Standardisierung von Ringprotokollen bereitzustellen. Auf diese Weise zielt das Manuskript darauf ab, die Reproduzierbarkeit von Daten aus Organoidmodellen von Hunden zu erleichtern, um ihre Relevanz in der translationalen biomedizinischen Forschung zu erhöhen.
Abbildung 1: Workflow von Organoidprotokollen für Hunde. Das Canine Organoid Isolation Protocol beschreibt die Vorbereitung der Materialien, die für die Organoidisolierung benötigt werden, die Entnahme einer Gewebeprobe (durch Nekropsie, endoskopische, laparoskopische und chirurgische Biopsien) und die Anleitung zur Zelldissoziation und -plattierung der Zellpopulation. Das Canine Organoid Maintenance Protocol behandelt die Reinigung und den Übergang der Organoidkultur. Das Organoid Harvesting and Biobanking Protocol diskutiert die Vorbereitung von Organoidproben für die Paraffineinbettung und die weitere Organoidcharakterisierung. Methoden zur Biobank-Organoidkultur und deren Wiederbelebung aus der Speicherung in flüssigem Stickstoff werden ebenfalls diskutiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Derzeit fehlen standardisierte Protokolle für die Isolierung und Aufrechterhaltung von Leber- und Darmorganoiden bei Hunden. Die Festlegung von Standardarbeitsanweisungen für Organoidkulturen ist gerechtfertigt, damit dieses Modell in verschiedenen Laborumgebungen anwendbar ist. Insbesondere die Bereitstellung standardisierter Betriebsprotokolle für die Kultur dieser kaninen Organoidmodelle ist der Schlüssel zur Charakterisierung des normalen Wachstums von Organoiden während der Kultur und des Passagings, um optimale Zeitpunkte für Expansion und Wartung abzuleiten. Canine Darmorganoide, die mit dem Protokoll kultiviert wurden, wurden zuvor von Chandra et al.12 charakterisiert.
Einer der kritischsten Schritte des Protokolls ist die Übertragung von Organoiden. Der optimale Zeitpunkt für die erste Passage von Lebersphäroiden wurde auf der Grundlage der Lebersphäroidmessungen am Tag 7 nach der Isolierung bestimmt. Das maximale Volumen der Sphäroide wurde am Tag 7 erreicht, und gleichzeitig begannen die Sphäroide zu knospen und bildeten hepatische Organoide. Der Anstieg des gesamten Organoidvolumens von Tag 2-7 nach der Isolierung betrug mehr als das 365-fache, was darauf hindeutet, dass die optimale Durchgangszeit länger ist als die der Organoidkultur des Hundedarms. Nach 7 Tagen in Kultur wurden keine groben Anzeichen einer zellulären Apoptose im Lebersphäroid beobachtet, auch ohne Reinigung oder Verlauf (Abbildung 7). Das Passieren der Darm- und Leberorganoide kann eine Herausforderung sein, da das Verfahren zum Verlust von Zellen und einer veränderten Lebensfähigkeit führen kann. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine längere Inkubation von Leberorganoiden mit trypsinähnlicher Protease (bis zu 12 min) die Subkultur nicht negativ beeinflusst. Die Inkubation der Organoide in trypsinartiger Protease für länger als 24 min kann der nachfolgenden Subkultur der Organoide abträglich sein.
Im Falle eines suboptimalen Bruchs in den Zellclustern mit der Organoidpassage könnte eine mechanische Dissoziation anstelle einer längeren Inkubation mit trypsinartiger Protease vorteilhafter sein. Wenn Probleme mit der ordnungsgemäßen Dissoziation der Organoide auftreten, kann versucht werden, die Durchgangsausbeute kurz zu wirbeln, um die Durchgangsausbeute zu erhöhen. Auf der anderen Seite hat das Vortexing das Potenzial, eine Kultur zu ruinieren und Zellen zu schädigen, so dass es nur verwendet werden sollte, wenn andere Verfahren wiederholt fehlgeschlagen sind. Das Aufbrechen hepatischer Organoide in einzelne Zellen senkt die Wachstumsrate der Organoide, während das Aufbrechen in Zellcluster ihre Lebensfähigkeit erheblich verbessern kann. Als Inkubationszeit für das Organoidprotokoll wurden zehn Minuten gewählt. Ein 12-minütiger Inkubationszeitpunkt wurde im Vergleich zu einer 24-minütigen Inkubation im Trypsin-ähnlichen Protease-Experiment als nicht zytotoxisch eingestuft.
Das Überlebensfähigkeitsexperiment bestätigte, dass hepatische Organoide von Hunden unter ungünstigen Bedingungen (strukturelle und ernährungsphysiologische Erschöpfung) bis zu 19,5 Tage überleben können. Organoide, die diese Bedingungen am längsten überlebten, wurden mit CMGF+-Medien kultiviert. Diese Beobachtung könnte durch das langsamere Wachstum von Leberorganoiden in Medien verursacht worden sein, die nicht mit Rock-Inhibitor und GSK3β ergänzt wurden. Organoide Kulturen mit CMGF+ R/G wuchsen schneller und haben ihre Ressourcen möglicherweise schneller erschöpft. Dieses Experiment eröffnet Möglichkeiten der Miniaturisierung der Organoidkultur bei Hunden, um eine Hochdurchsatz-Systemumwandlung zu erreichen. Eine solche Technologie zeigt das Potenzial, die Arzneimittelforschung oder toxikologische Studien zu wesentlich reduzierten Kosten zu erleichtern.
Einige häufige Probleme, die während der Aufrechterhaltung der Organoidkultur bei Hunden auftreten, sind eine unsachgemäße Probenerstarrung beim Plattieren, eine Kulturkontamination und die Bestimmung der richtigen Dichte und Größe der Organoide. Wenn sich das gelöste ECM während der Beschichtung vorzeitig verfestigt, legen Sie es sofort für 10 min auf Eis. Wenn solubilisiertes ECM keine kuppelartigen Strukturen bildet, ist es wahrscheinlich, dass nicht genügend Medien aus der Probe entfernt wurden. Wenn dies der Fall ist, verdünnen Sie die Probe mit einem stärker gelösten ECM, bis sich Kuppeln bilden.
Wenn eine pilzliche oder bakterielle Kontamination in einer ganzen Platte gefunden wird (siehe Abbildung 4), besteht die beste Lösung darin, die Platte zu entsorgen. Die Behandlung mit antimykotischen oder antibiotischen Medikamenten kann versucht werden, aber der Erfolg eines solchen Versuchs ist extrem gering. Wenn ein einzelnes Bohrloch in einer Platte kontaminiert ist, können lebensfähige und nicht betroffene Bohrlöcher (Schritte 4.1 bis 4.5) zu einer neuen Platte gereinigt und genau überwacht werden. Wenn die Probe bereits im Notfall eingefroren wurde, ist es ratsam, die gesamte Probe zu entsorgen, da das Auftauen der Probe den Inkubator einem zusätzlichen Kontaminationsrisiko aussetzt.
Eine gesunde Organoidkultur sollte mindestens in der Kategorie mittlerer Größe und mittlerer Dichte oder größer sein. Eine optimale Dichte ist entscheidend für das Wachstum der Organoidkultur. Eine geringere Dichte muss korrigiert werden, indem die Organoide auf mittlere Dichte gereinigt werden. Wenn die Situation der extremen Dichte auftritt (Überfüllung), sollten die Organoide auf weitere Brunnen ausgedehnt werden. Grobe Anzeichen einer zellulären Apoptose begleiten oft sowohl die Überfüllung als auch die geringe Dichte der Organoidkultur. Wenn diese Probleme nicht rechtzeitig behoben werden, wird die gesamte Organoidkultur innerhalb weniger Tage apoptotisch. Wenn Organoide eine besonders große Größe oder eine sehr hohe Dichte erreichen, sollte die Kultur für ein Experiment, Einfrieren oder Fixieren verwendet werden.
Das Organoidmedium enthält derzeit 17 Komponenten, und die Zugabe von Wachstumsfaktoren, die für die Erhaltung und Expansion von Organoiden benötigt werden, kann daher teuer sein. Dieses Problem kann durch das Züchten von 2D-Zellkulturen gelöst werden, die die Wachstumsfaktoren synthetisieren, um konditioniertes CMGF+ zu erzeugen. Zellkultur L-WRN produziert Wnt-3a, R-Spondin-3 und Noggin Wachstumsfaktoren37. Die Zellkolonie verwendet 90% DMEM/F12 und 10% FBS Kulturmedien. Wenn die Kultur 90 Prozent Konfluenz erreicht, werden Medien 1 Woche lang jeden Tag geerntet. Die geernteten Medien werden dann mit 2x CMGF+ (ohne diese Wachstumsfaktoren) gemischt. Während 2D-Kulturen die erforderlichen Wachstumsfaktoren zu einem Bruchteil der Kosten erzeugen können, muss mit der zusätzlichen Zeit und Vorbereitung zur Herstellung der Medien gerechnet werden. Die Konzentrationen von Wachstumsfaktoren zwischen konditionierten Medienchargen können ebenfalls unterschiedlich sein37,38.
Aus adulten Stammzellen gewonnene Organoidkulturen von Hunden sind ein einzigartiges biomedizinisches Modell, das dazu beitragen kann, die Ziele der One Health Initiative39 zu erreichen. Die Organoidtechnologie kann in vielen grundlegenden und biomedizinischen Forschungsbereichen eingesetzt werden, von der Entwicklungsbiologie, Pathophysiologie, Wirkstoffforschung und -prüfung, Toxikologie bis hin zur Erforschung von Infektionskrankheiten und regenerativer Medizin40. Translationale und umgekehrte translationale Forschung sind beide Bereiche, in denen Hundeorganoide anwendbar sind15. Hunde werden seit Jahrhunderten in translationalen experimentellen Umgebungen eingesetzt, und ihr Status als Haustier hat auch ihre Position als eine der am meisten erforschten Arten in der Veterinärmedizin erleichtert.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Manuskript standardisierte Betriebsprotokolle für die Isolierung, Wartung, Ernte und das Biobanking von Leber- und Darmorganoiden bei Hunden bereitstellt, um die Anwendung dieses Modells in verschiedenen biomedizinischen Bereichen zu erleichtern. Dieses Modell eignet sich in einzigartiger Weise, um die reverse translationale Forschung als Instrument der One Health Initiative zur Förderung des inter- und intradisziplinären Wissensaustauschs zu fördern.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren möchten den Mitarbeitern des Veterinary Diagnostic Laboratory der Iowa State University, nämlich Haley M. Lambert, Emily Rahe, Rosalyn M. Branaman, Victoria J. Green und Jennifer M. Groeltz-Thrush, für die rechtzeitige Verarbeitung der zur Verfügung gestellten Proben danken. Die Autoren möchten die Unterstützung des Faculty Startup, des ISU VPR Miller Award, des ISU VPR Miller Award und des NSF SBIR Sub-Award für ISU # 1912948 anerkennen.
Chelating solution | |||
D-Sorbitol | Fisher Chemical | BP439-500 | |
DTT | Promega | V3151 | |
KCl | Fisher Chemical | P217-500 | |
KH2PO4 | Sigma | P5655-100G | |
Na2HPO4-2H2O | Sigma | S5136-100G | |
NaCl | Fisher Chemical | S271-500 | |
Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
Sucrose | Fisher Chemical | S5-500 | |
Organoid media | |||
[Leu15]-Gastrin I human | Sigma | G9145-.5MG | |
A-83-01 | PeproTech | 9094360 | |
Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
FBS | Corning | 35-010-CV | |
Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
HEPES | VWR Life Science | J848-500ML | |
Human R-Spondin-1 | PeproTech | 120-38-500UG | |
Murine EGF | PeproTech | 315-09-1MG | |
Murine Noggin | PeproTech | 250-38-250UG | |
Murine Wnt-3a | PeproTech | 315-20-10UG | |
N2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165-25G | |
Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | |
Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
ROCK inhibitor (Y-27632) | EMD Millipore Corp. | SCM 075 | |
SB202190 (P38 inhibitor) | Sigma | S7067-25MG | |
Stemolecule CHIR99021 (GSK3β) | Reprocell | 04-0004-base | |
Trimethoprim | Sigma | T7883-5G | |
Sulfamethoxazole | Sigma-Aldrich | S7507-10G | |
Reagents | |||
Acetic Acid, Glacial | Fisher Chemical | A38-500 | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Chemicals | D128-500 | |
EDTA, pH 8.0, 0.5 M | Invitrogen | 15575-038 | |
Formaldehyde (37%) | Fisher Chemical | F79P-4 | |
Glutaraldehyde solution | Sigma | G5882 | |
Matrigel Matrix For Organoid Culture | Corning | 356255 | Extracellular Membrane Matrix |
Paraformaldehyde, 97% | Alfa Aesar | A11313 | |
PBS, 1X (Phosphate-Buffered Saline) | Corning | 21-040-CM | |
PBS, 1X (Phosphate-Buffered Saline) | Corning | 21-040-CM | |
RNAlater Soln. | Invitrogen | AM7021 | RNA Storage Reagent |
TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | Trypsin-like Protease |
Diğer | |||
6 Well Cell Culture Plate | Corning | 3516 | |
ACD Hybez II Hybridization System | ACD a biotechne brand | 321710 | |
Centrifuge Tube, 15 mL | Corning | 430766 | |
CoolCell LX | Corning | BCS-405MC | |
Cryogenic Vials | Corning | 430488 | |
Disposable Centrifuge Tube (50 mL) | Fisherbrand | 05-539-13 | |
GyroMini Nutating mixer (Rocker) | Labnet | S0500-230V-EU | |
Heat Bath | Lab-Line Instruments | 3000 | |
Mr. Frosty Freezing Container | ThermoFisher Scientific | 5100-0001 | |
NanoDrop 2000 | ThermoFisher Scientific | ND2000CLAPTOP | SpectrophotometerAnalysis |
Panasonic incubator | Panasonic | MCO-170ML-PA | |
Parafilm M Wrapping Film | Bemis Company Inc | PM996/EMD | Laboratory Flexible Film Tape |
Protected Disposable Scalpels | Bard-Parker | 239844 | |
RNAscope 2.5 HD Assay – RED | ACD a biotechne brand | 322350 | |
RNAscope H2O2 & Protease Plus Reagents | ACD a biotechne brand | 322330 | |
RNAscope Target Retrieval Reagents | ACD a biotechne brand | 322000 | |
RNAscope Wash Buffer Reagents | ACD a biotechne brand | 310091 | |
Tissue Culture Dish | Dot Scientific | 6676621 | |
Tissue Culture Plate 24 wells | Fisherbrand | FB012929 |