Isolatie van primaire microglia van muizen door magnetisch geactiveerde celsortering in diermodellen van demyelinisatie

Microglia zijn afkomstig van dooierzakvoorlopers, die zeer vroeg de embryonale hersenen bereiken en deelnemen aan de ontwikkeling van het CZS ^1,2. Ze zijn bijvoorbeeld betrokken bij synaptisch snoeien³ en het reguleren van axonale groei⁴. Ze scheiden factoren af die neuronale overleving bevorderen en neuronale lokalisatie helpen⁵. Tegelijkertijd zijn ze betrokken bij het verwijderen van abnormale cellen en apoptotische cellen om een normale hersenontwikkeling te garanderen⁶. Bovendien, als de immuun-competente cellen van de hersenen, surveilleren microglia voortdurend het hersenparenchym om dode cellen, disfunctionele synapsen en cellulair puin^{op te ruimen 7}. Het is aangetoond dat microgliale activering een belangrijke rol speelt bij een verscheidenheid aan ziekten, waaronder inflammatoire demyeliniserende ziekten, neurodegeneratieve ziekten en hersentumoren. Geactiveerde microglia bij multiple sclerose (MS) dragen bij aan de differentiatie van oligodendrocytenvoorlopercellen (OPC’s) en regeneratie van myeline door myeline-puin te verzwelgen⁸.

Bij de ziekte van Alzheimer (AD) activeert accumulatie van amyloïde bèta (Aβ) microglia, die de fagocytische en ontstekingsfuncties van microglia⁹ beïnvloeden. Geactiveerde microglia in het glioomweefsel, glioom-geassocieerde microglia (GAM) genoemd, kunnen de progressie van glioom reguleren en uiteindelijk de prognose van patiënten^{beïnvloeden 10}. De activering verandert het microgliale transcriptoom grondig, wat resulteert in morfologische veranderingen, expressie van immuunreceptoren, verhoogde fagocytische activiteit en verbeterde cytokinecretie¹¹. Er zijn verschillende subsets van geactiveerde microglia bij neurodegeneratieve ziekten zoals ziekte-geassocieerde microglia (DAM), geactiveerde respons microglia (ARM) en microgliaal neurodegeneratief fenotype (MGnD)⁸.

Evenzo bestaan er ook meerdere dynamische functionele subsets van microglia naast elkaar in de hersenen bij inflammatoire demyeliniserende ziekten¹². Het begrijpen van de heterogeniteit tussen verschillende subsets van microglia is essentieel om de pathogenese van inflammatoire demyeliniserende ziekten te onderzoeken en hun potentiële therapeutische strategieën te vinden. De heterogeniteit van microglia hangt vooral af van de moleculaire specificiteit⁸. Het is essentieel om de moleculaire veranderingen van microglia nauwkeurig te beschrijven voor de studie van de heterogeniteit. Vooruitgang in eencellige RNA-sequencing (RNA-seq) technologie heeft de identificatie van de moleculaire kenmerken van geactiveerde microglia in pathologische omstandigheden^{mogelijk gemaakt 13}. Daarom is het vermogen om celpopulaties te isoleren van cruciaal belang voor verder onderzoek van deze doelcellen onder specifieke omstandigheden.

Studies die worden uitgevoerd om de kenmerken en functies van microglia te begrijpen, zijn meestal in vitro studies, omdat is gebleken dat grote aantallen primaire microglia kunnen worden bereid en gekweekt uit muizenjonghersenen (1-3 dagen oud), die zich hechten aan de kweekkolven en groeien op het plastic oppervlak met andere gemengde gliacellen. Vervolgens kunnen zuivere microglia worden geïsoleerd op basis van de verschillende kleefkracht van gemengde gliacellen^14,15. Deze methode kan echter alleen microglia isoleren uit de perinatale hersenen en duurt enkele weken. Potentiële variabelen in celkweek kunnen microgliale kenmerken beïnvloeden, zoals moleculaire expressie¹⁶. Bovendien kunnen microglia die door deze methoden worden geïsoleerd alleen deelnemen aan in vitro experimenten door de omstandigheden van CZS-ziekten te simuleren en kunnen ze niet de kenmerken en functies van microglia in in vivo ziektetoestanden vertegenwoordigen. Daarom is het noodzakelijk om methoden te ontwikkelen voor het isoleren van microglia uit het volwassen muizenbrein.

Fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) en magnetische scheiding zijn twee veelgebruikte methoden, hoewel ze hun eigen verschillende beperkingen hebben 16,17,18,19. Hun respectievelijke voor- en nadelen zullen in het discussiegedeelte worden vergeleken. De rijping van MACS-technologie biedt de mogelijkheid om cellen snel te zuiveren. Huang et al. hebben een handige methode ontwikkeld om demyeliniserende laesies in hersenen te labelen²⁰. Door deze twee technische benaderingen te combineren, stellen we een snel en efficiënt kolomvormig CD11b magnetisch scheidingsprotocol voor, met een stapsgewijze beschrijving om microglia te isoleren rond demyeliniserende laesies in volwassen muizenhersenen en de moleculaire kenmerken van microglia te behouden. De focale demyeliniserende laesies werden veroorzaakt door de stereotactische injectie van 2 μL lysolecithine-oplossing (1% LPC in 0,9% NaCl) in het corpus callosum 3 dagen voor aanvang van het protocol²¹. Dit protocol legt de basis om de volgende stap in in vitro experimenten uit te voeren. Bovendien bespaart dit protocol tijd en blijft het haalbaar voor wijdverbreid gebruik in verschillende experimenten.